薛中會(huì)

(上海出版印刷高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)部，上海 200093)

基于蛋白質(zhì)和其它生物分子的分子仿生學(xué)(molecular biomimetics)是在分子水平上利用生物礦化原理對(duì)材料和體系的功能、結(jié)構(gòu)的仿生合成[1].近年來，對(duì)脊椎動(dòng)物的骨骼和牙齒[2]、軟體動(dòng)物和甲殼類動(dòng)物外殼[3，4]、單細(xì)胞生物硅藻[5]等的生物礦物形成過程的研究結(jié)果表明這些生物礦物材料都是在特定的蛋白質(zhì)和/或其它生物大分子調(diào)控下的納米顆粒的分級(jí)有序組裝.受這個(gè)重要的生物體合成材料的啟發(fā)，人們從天然蛋白和人工合成的多肽中篩選出能夠控制和誘導(dǎo)無機(jī)顆粒生長(zhǎng)的有用品種，進(jìn)而利用它們研究對(duì)無機(jī)材料形貌、尺寸、晶型和取向的調(diào)控作用[6-8].

受生物體合成無機(jī)材料過程和原理的啟發(fā)，利用生物礦化原理在實(shí)驗(yàn)室模擬合成無機(jī)納米顆粒成為材料學(xué)家研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域.生物體合成材料具有幾個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)：(1)常溫，常壓下合成；(2)中性酸堿度下合成；(3)利用材料和“試劑”無毒.這三個(gè)特點(diǎn)和現(xiàn)代材料綠色合成的三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)非常適應(yīng).因此，根據(jù)上面的三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，利用微生物或生物分子合成納米粒子是一個(gè)理想的選擇[9，10].

金納米粒子由于其特殊的性質(zhì)，在許多領(lǐng)域具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用，如在催化、生物傳感、生物標(biāo)記和蛋白質(zhì)的電泳分離等方面的應(yīng)用.對(duì)微生物成礦的研究表明，某些細(xì)菌有對(duì)金離子富集，進(jìn)而還原成單質(zhì)金的能力，如Gridlock等報(bào)道的金生物礦化過程[10].目前，形狀可控的金納米粒子的合成一般采用光化學(xué)，溶液化學(xué)、生物化學(xué)和Langmuir單層膜的方法[8-11].在這些方法中，利用生物礦化原理在較為溫和的條件下合成形貌和尺寸均一的金納米粒子逐漸成為研究的熱點(diǎn)，如Yang等利用溶菌酶作為修飾劑在氯金酸和硼氫酸鈉溶液中也對(duì)形成的金納米粒子的單層包覆[12]；Nayak等利用賴氨酸實(shí)現(xiàn)了氯金酸的還原，并且賴氨酸包覆金納米粒子的表面[13]；Bai等利用1-hexadecyl-3-methylimidazolium bromide單層膜在氣-液界面合成了取向生長(zhǎng)的金微米顆粒，這些研究對(duì)金納米粒子的仿生合成起到了重要的推動(dòng)作用[14].然而，目前很少采用表征和分析較為完善和清楚的蛋白質(zhì)單層膜控制金的仿生合成，本文利用BSA單層膜調(diào)制形成金納米粒子，獲得了較好的研究結(jié)果.

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　材料和方法

HAuCl4和BSA：美國(guó)Sigma Aldrich公司，使用時(shí)未經(jīng)任何提純；使用三次蒸餾后的去離子水(Ultrapur e Millipore water，18.2 MΩ)作為溶劑，由于HAuCl4對(duì)鉑片具有較強(qiáng)的腐蝕作用，選擇和鉑片相同重量的濾紙作為膜片，測(cè)試表面壓.

參考文獻(xiàn)[15]配備BSA的水溶液作為成膜物質(zhì)；配備0.0010 mM的HAuCl4水溶液作為亞相.把新配備的HAuCl4水溶液倒入清洗干凈的LB槽中，快速清理表面后用微量進(jìn)樣器鋪上面配好的BSA的水溶液到HAuCl4液面上，保持穩(wěn)定30 min后開始?jí)耗?，到目?biāo)壓15 mN/m后保持不同的時(shí)間，最后把保持不同時(shí)間的樣品提摸到已處理過的玻璃片和銅網(wǎng)上.所有實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行.

1.2　表征

JSM-5600掃描電子顯微鏡(SEM)，日本電子株式會(huì)社(JEOL Ltd.)；X’Pert Pro MPD X射線粉末衍射儀(XRD)，荷蘭Philips，Cu-Kα：0.15406 nm；JEOL-2010投射電子顯微鏡(HRTEM)測(cè)試，日本電子株式會(huì)社(JEOL Ltd.).

2　結(jié)果和討論

2.1　投射電子顯微鏡和高分辨結(jié)果

圖1a是在BSA膜界面反應(yīng)不同時(shí)間得到的樣品的TEM圖.從圖1a可以看出，反應(yīng)12 h得到了大量密集的納米顆粒，尺寸分析表明粒徑在2 nm左右的金納米顆粒.圖1a中右上角是納米顆粒對(duì)應(yīng)的SAED圖，彌散的環(huán)表明形成的金納米顆粒為無定型態(tài)金.圖1b是反應(yīng)24 h在膜界面得到的金顆粒的大范圍低放大倍數(shù)TEM圖，可以看出生成了大量的球形納米粒子，同時(shí)也觀察到了少量的三角形納米粒子.圖1c是反應(yīng)24 h在膜界面得到的金顆粒的小范圍高放大倍數(shù)TEM圖.從圖中可以明顯地看出已經(jīng)有三角形金粒子形成，尺寸在100 nm左右，同時(shí)也觀察到大量的尺寸在30 nm球形金納米粒子，而且球形金納米粒子是許多小的粒子聚集體，如圖1c中白色斷點(diǎn)圓包圍的區(qū)域.圖1c右上角的插圖是三角形金顆粒的SAED圖，明顯的規(guī)律分布的點(diǎn)陣衍射點(diǎn)表明三角形金納米是單晶結(jié)構(gòu).圖1d，e是當(dāng)反應(yīng)時(shí)間推進(jìn)到36 h獲得樣品的TEM低倍圖和高倍圖，從圖1d可以看出三角形、切去尖端的三角形和六角型金納米粒子形成.圖1e的TEM高倍數(shù)的放大圖表明尺寸大約在500 nm左右，而且三角形的三個(gè)邊非常的粗糙；圖1e中的插圖是三角形對(duì)應(yīng)的SAED，強(qiáng)而清晰的規(guī)律型衍射斑點(diǎn)表明所形成的三角形金納米粒子是單晶金.繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到48 h，獲得更大的金納米粒子.圖1f是反應(yīng)48 h得到的金納米粒子，從圖中可以看出形成的仍是三角形金粒子.仔細(xì)分析發(fā)現(xiàn)盡管三角形的尺寸沒有發(fā)生較大的變化，但是三角形的邊界已經(jīng)變得不是那么粗糙，圖1f中的插圖是對(duì)應(yīng)的SAED，更加清晰的衍射斑點(diǎn)說明金納米顆粒的晶化已經(jīng)很好.TEM和對(duì)應(yīng)的SAED表明BSA分子有能力控制BSA形成單晶結(jié)構(gòu)，在不同的時(shí)間可以得到不同尺寸的單晶金納米粒子.圖2是圖1f對(duì)應(yīng)的HRTEM圖，方向一致的晶格條紋進(jìn)一步說明形成了單晶結(jié)構(gòu)的金粒子.

圖1　BSA單層膜界面生長(zhǎng)不同時(shí)間得到的金粒子的SEM和TEM圖，(a)12 h；(b,c)24 h；(d,e)36 h；(f)48 h.

2.2　XRD結(jié)果

TEM，SEM和SAED圖已經(jīng)表明反應(yīng)時(shí)間影響著金粒子的成核和生長(zhǎng).僅僅通過上面的結(jié)果，還不能表明我們得到的單晶金是歸屬于哪種晶型.XRD是表征晶體結(jié)構(gòu)的非常有用的手段，借助于XRD我不但能夠辨別出晶體的相結(jié)構(gòu)而且能從衍射峰的相對(duì)強(qiáng)弱的變化給出晶體生長(zhǎng)的取向面.

圖2　三角形片狀金顆粒的HRTEM圖

圖3　不同時(shí)間樣品的XRD圖：(a)12 h；(b)24 h；(c)36 h；(d)48 h

圖3a，b，c和d分別表示BSA單層膜控制下金晶化12 h，24 h，36 h和48 h的XRD圖.圖3a表明沒有任何衍射峰出現(xiàn)，說明此時(shí)形成的金顆粒無定型納米粒子，和圖1a中的插圖SAED結(jié)果相對(duì)應(yīng).和12 h的結(jié)果相比，晶化24 h樣得到的金粒子的XRD只有一個(gè)衍射峰，衍射角為38.24°，通過和標(biāo)準(zhǔn)圖譜相對(duì)比，指認(rèn)為面心立方晶型金的(111)晶面，JCPSD卡號(hào)為04-0784，單一衍射峰的出現(xiàn)可能是由于取向生長(zhǎng)的結(jié)果，為此我們進(jìn)一步考察了更長(zhǎng)時(shí)間樣品的XRD圖譜；相比而言晶化36 h和48 h的金粒子的XRD衍射峰都出現(xiàn)兩個(gè)衍射峰，角度為38.24°和81.78°，分別對(duì)應(yīng)于面心立方晶型金的(111)晶面和(222)晶面，由于(222)晶面是(111)晶面的次級(jí)衍射.(222)晶面的出現(xiàn)是由于金晶體更為完全的結(jié)構(gòu)，這點(diǎn)和我們?cè)趫D1e和1f插圖中的SAED圖譜的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)相一致.結(jié)合XRD結(jié)果和SAED結(jié)果，可以看出在BSA單層膜控制下形成了呈現(xiàn)沿(111)晶面取向生長(zhǎng)的面心立方的金單晶粒子.同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)金粒子的晶型經(jīng)歷了一個(gè)從無定型到晶態(tài)轉(zhuǎn)變的過程.這點(diǎn)和BSA單層作用下碳酸鈣的晶型轉(zhuǎn)變過程相類似，關(guān)于碳酸鈣從無定型到晶態(tài)的轉(zhuǎn)變過程我們?cè)谇皫渍乱炎隽嗽敿?xì)的說明，在此不做過多的解釋.總的來說，在BSA單層膜調(diào)制下，晶化的初始階段形成無定形的金粒子，隨著晶化時(shí)間的延長(zhǎng)，無定型粒子逐漸轉(zhuǎn)變成單晶結(jié)構(gòu)的金粒子，并沿(111)面取向生長(zhǎng).

結(jié)合SEM，TEM，SAED和XRD的結(jié)果，我們可以看出，BSA單層膜能控制金粒子的成核、尺寸、形貌和取向生長(zhǎng).但是BSA單層膜是如何實(shí)現(xiàn)這種控制作用？很明顯，通過金晶體生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)演變過程能夠完全解析BSA的作用的.因此在下面的討論部分，我們探索性地探討了BSA的作用和影響.

2.3　BSA單層膜和金粒子的分子識(shí)別

如上所述，分子識(shí)別機(jī)制主要的內(nèi)容和生物礦化的一般原理相一致.但是問題的關(guān)鍵是我們實(shí)驗(yàn)中用到的BSA和金粒子之間如何通過分子識(shí)別發(fā)生相互作用.結(jié)合以上的文獻(xiàn)報(bào)到和有關(guān)BSA的物理化學(xué)性質(zhì)，我們對(duì)BSA和金粒子之間的分子識(shí)別機(jī)制做了一些探究.首先溶液中的氯金酸離子通過和BSA功能集團(tuán)的相互作用還原出游離的單質(zhì)金，該種還原作用一定和BSA分子中的某些具有還原功能的氨基酸殘基密切相關(guān)，如含—HS的殘基[16-21]等；而后游離的金單質(zhì)形成團(tuán)簇，進(jìn)而進(jìn)化成無定型態(tài)金粒子，BSA在次過程中起著穩(wěn)定和組裝無定型相的作用，可能和BSA分子中存在的半胱氨酸殘基(BSA分子氨基酸序列中的第35個(gè)氨基酸殘基)相關(guān)，二者之間形成了Au—S形式鍵[22]；Xie等研究了BSA存在于四氯金酸溶液中時(shí)對(duì)金粒子的形貌的影響[20]，他們分析認(rèn)為BSA中的某些氨基酸殘基對(duì)片狀結(jié)構(gòu)金粒子的形成起著重要的作用.他們推測(cè)BSA分子中的天門冬氨酸殘基和谷氨酸殘基中的—COO-離子是形成片狀金粒子的基本離子.我們實(shí)驗(yàn)研究的是蛋白質(zhì)在膜界面時(shí)對(duì)金粒子的調(diào)控作用.二者之間可能存在形式上的差異，但是在分子相互作用上沒有差別，因?yàn)樾问缴系牟煌荒軐?dǎo)致BSA分子物理狀態(tài)的不同，不會(huì)引起化學(xué)性質(zhì)的變化，所以BSA分子和金粒子之間的化學(xué)作用沒有變化.

單層膜的對(duì)晶體的調(diào)控作用的一個(gè)重要特征就是能實(shí)現(xiàn)對(duì)晶體生長(zhǎng)取向的控制.盡管Xie等人利用BSA實(shí)現(xiàn)對(duì)金粒子形貌和尺寸的調(diào)控[20]，他們忽略了對(duì)金粒子取向生長(zhǎng)性的研究，同時(shí)他們采用的調(diào)控溫度較高(37-70 ℃之間).受BSA調(diào)控碳酸鈣取向生長(zhǎng)的啟發(fā)[23，24]，我們對(duì)BSA作用下金粒子的取向生長(zhǎng)做了分析討論.

圖4　推測(cè)的BSA單層膜和金(111)面的晶面匹配示意圖.(a)BSA在純水界面的模型；(b)金(111)晶面的示意圖；(c)BSA在四氯金酸亞相上的模型示意圖；(d)BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)和金(111)晶面的匹配圖

示意圖4a，b是BSA分子和面心立方晶體金(111)面二維點(diǎn)陣示意圖.由α-螺旋平行排列的BSA單層膜具有正交結(jié)構(gòu)，晶胞參數(shù)為a=0.58和b=0.54 nm[25](圖4a)，分別對(duì)應(yīng)于α-螺旋鏈間距和螺距；圖4b是金的(111)晶面示意圖，具有參數(shù)為a1=b1=0.29 nm，θ=120°菱形結(jié)構(gòu).研究表明BSA的螺旋結(jié)構(gòu)是平行與界面的有規(guī)律擺列，即由螺旋形成的a-b面是平行于膜界面的.因此結(jié)合第三章碳酸鈣和BSA螺旋結(jié)構(gòu)的晶面匹配關(guān)系，我們推測(cè)BSA螺旋結(jié)構(gòu)形成的ab面有可能和Au的ab面在結(jié)構(gòu)上存在晶面面匹配現(xiàn)象[26].

然而，從表面上來看，BSA由α-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的a-b面和有金的(111)面中的Au形成的a-b面的晶胞參數(shù)上不存在匹配關(guān)系.但是我們必須注意到三個(gè)方面：(1)無論有機(jī)模板還是無機(jī)材料在膜界面的礦化結(jié)晶過程，它們都不是剛性的二者都會(huì)通過結(jié)構(gòu)的重排相互適應(yīng)，達(dá)到良好的匹配效果[27]；(2)研究表明有機(jī)模板的柔性和無機(jī)粒子初期的無定形態(tài)的可塑性是二者重排的關(guān)鍵因素[28-31]；(3)文獻(xiàn)報(bào)到表明在結(jié)構(gòu)失配度30%以內(nèi)晶體和有機(jī)模板都可以通過結(jié)構(gòu)重排來時(shí)先匹配[31，32].通過模板柔韌性的調(diào)整和結(jié)構(gòu)調(diào)整，二者之間相互適應(yīng)，到達(dá)如圖4c，d所示匹配關(guān)系.具體如下：BSA由α-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的ab面和有金的(111)面中的Au形成的ab面的晶胞參數(shù)存在如下關(guān)系：a=2a1和b≈1.73b1，失配度為8%遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于最大失配度30%，文獻(xiàn)報(bào)道在達(dá)到30%失配仍可相互適應(yīng)而匹配[32].

2.4　BSA單層膜調(diào)制下金粒子的成核和晶化機(jī)制

經(jīng)典結(jié)晶理論表明，成核和生長(zhǎng)是晶體形成的兩個(gè)關(guān)鍵步驟.溶液中的成核物種通過聚集形成較大的團(tuán)簇，長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的團(tuán)簇達(dá)到臨界成核程度后，晶體開始成核；而后新晶核形成后，溶液中的離子或分子不斷地吸附到晶核表面，晶核逐漸長(zhǎng)大，形成晶體，這就是晶體的生長(zhǎng)過程.在我們研究的BSA單層膜調(diào)制下的晶化實(shí)驗(yàn)中，SAED圖和XRD衍射圖表明金晶體粒子的是通過無定形態(tài)的金粒子轉(zhuǎn)變形成的，不是經(jīng)典的生長(zhǎng)過程.大量的研究也表明，生物礦化和模擬生物礦化下的碳酸鈣、磷酸鈣晶化過程是一個(gè)不同于經(jīng)典結(jié)晶理論描述的結(jié)晶過程.一般先在大分子的作用下形成無定型礦物，而后無定型礦物經(jīng)歷溶解和再結(jié)晶過程轉(zhuǎn)變成晶態(tài)礦物.結(jié)合生物礦化的非經(jīng)典結(jié)晶機(jī)制和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)BSA單層膜作用下金晶體粒子的成核和生長(zhǎng)過程如圖5所示.首先溶液中的金粒子被BSA分子還原出來，由于金粒子帶正點(diǎn)，通過電荷吸引的作用溶液中被還原的金吸附到BSA單層膜界面，形成無定形態(tài)的金納米聚集體，圖5a，b所示；隨著反應(yīng)的深入，無定型納米金團(tuán)簇轉(zhuǎn)變成片狀的金晶態(tài)粒子；隨著反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行，片狀的金晶體粒子不斷地吸附無定型金納米粒子到三角形片狀結(jié)構(gòu)的邊上，金晶體逐漸變大，如圖5c和d所示.無定型態(tài)金粒子吸附到三角形邊界的現(xiàn)象可以從圖1c，e和f中三角形片狀金粒子的粗糙邊界和邊界上的納米聚集體得到很好的證明，如圖1c，e和f中的白色箭頭所示.隨著反應(yīng)時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，晶體生長(zhǎng)速度變慢，這可能是由于溶液中晶化物種的逐漸耗盡所致，從圖1f周圍納米粒子的減少中得到印證，從上面的討論可以看出溶液中的金在BSA的調(diào)控下經(jīng)歷一個(gè)從無定形-聚集體-晶化-長(zhǎng)大的過程，簡(jiǎn)單來講就是從不穩(wěn)定態(tài)到穩(wěn)定態(tài)，從小粒子到大粒子的成核、晶化和生長(zhǎng)的過程.這也和Ostward-Lussac定律相一致，Ostward等認(rèn)為晶體的生長(zhǎng)是從不穩(wěn)定態(tài)到穩(wěn)定態(tài)的逐漸轉(zhuǎn)變過程，粒子的變大來源于較小粒子因?yàn)榫哂休^大的表面能，所以也不穩(wěn)定，易于被吸附到角的粒子的表面，使得較大可以變得更大，較小顆粒逐漸減少[33，34]，也即是大家通常認(rèn)為的“大魚吃小魚”現(xiàn)象.我們研究表明金在蛋白質(zhì)作用下從離子元素到固態(tài)單質(zhì)晶體的晶化過程和蛋白質(zhì)調(diào)制作用下的碳酸鈣的礦化過程非常相似.或許我們可以這樣推測(cè)細(xì)菌微生物富集和還原金離子或許也經(jīng)歷里了相似的過程[35，36].因此該研究不但對(duì)于理解蛋白質(zhì)作用下的礦化機(jī)制有重要的作用，而且對(duì)于利用蛋白質(zhì)富集微量貴金屬的生物選礦過程有重要的潛在的應(yīng)用價(jià)值.

圖5　BSA單層膜作用下金粒子成核和生長(zhǎng)的可能過程

3　結(jié)　論

通過簡(jiǎn)單的模擬生物礦化方法，在室溫沒有添加任何還原劑的條件下仿生合成了三角形片狀結(jié)構(gòu)面心立方晶系的單晶金納米粒子.研究結(jié)果表明BSA單層膜作為一種多功能生物大分子單層膜.相對(duì)短的反應(yīng)時(shí)間有利于形成無定型態(tài)金粒子，較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間易于形成單晶結(jié)構(gòu)取向生長(zhǎng)的金粒子.研究能為綠色條件下合成具有特定功能和應(yīng)用潛力的納米材料提供幫助和借鑒.另外，該研究能為利用生物分子對(duì)礦物的特定作用進(jìn)行生物選礦提供借鑒.