汪　輝,　黃小貝,　劉　江,　王　柯,　葛　芬

(長沙市食品藥品檢驗(yàn)所, 湖南 長沙 410016)

愛德萬甜(N-{N-[3-(3-羥基-4-甲氧基苯基)丙基]-L-α-天冬氨酰}-L-苯丙氨酸-1-甲酯)的分子式為C24H30N2O75H2O,為白色粉末,是一種20 000倍蔗糖甜度的超高倍甜味劑[1]。當(dāng)達(dá)到相同的甜度,愛德萬甜的用量可以遠(yuǎn)低于現(xiàn)有市場上的蔗糖和其他高倍甜味劑。歐洲食品安全局和美國食品藥品管理局對(duì)其做了規(guī)定,每日允許攝入量分別為不超過5和32.8 mg/kg·bw[2,3]。國家衛(wèi)生計(jì)生委于2017年10月20日發(fā)布第8號(hào)公告《關(guān)于愛德萬甜等6種食品添加劑新品種、食品添加劑環(huán)己基氨基磺酸鈉(又名甜蜜素)等6種食品添加劑擴(kuò)大用量和使用范圍的公告》[1],正式批準(zhǔn)允許愛德萬甜作為新品種的食品添加劑添加至部分食品中,同時(shí)對(duì)相關(guān)食品如飲料、發(fā)酵乳和果凍等作了限量規(guī)定,其限量值比GB 2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中其他甜味劑的限量值低3～4個(gè)數(shù)量級(jí),即達(dá)到痕量級(jí)別。目前,食品行業(yè)仍存在超限量、超范圍使用添加劑的亂象,尤其在不熟悉新品種甜味劑特性且限量值與其他甜味劑相差較大的情況下可能會(huì)更加嚴(yán)重。因此,開發(fā)測定食品中的愛德萬甜高靈敏度的檢測方法非常必要且迫在眉睫。

目前,國內(nèi)外關(guān)于愛德萬甜的報(bào)道較少,關(guān)于食品中愛德萬甜的檢測方法甚少[4,5]。同為食品添加劑的糖精鈉、紐甜、甜蜜素和三氯蔗糖等甜味劑因其限量值較高,一般儀器分析方法如高效液相色譜法、氣相色譜法的檢出限均能達(dá)到檢測目的[6-8]。愛德萬甜由于限量值最低達(dá)到了0.4 mg/kg,采用紫外吸收光譜法、高效液相色譜法和氣相色譜法已經(jīng)無法滿足其檢測需求。因此,本文結(jié)合愛德萬甜的物理和化學(xué)性質(zhì),以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜高靈敏度的特性,通過優(yōu)化色譜、質(zhì)譜分析條件、考察基質(zhì)效應(yīng),開發(fā)了快速測定食品中愛德萬甜的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法具有前處理快速、簡便易行,靈敏度和準(zhǔn)確度高,檢測周期短等特點(diǎn),適用于飲料、酸奶和果凍中愛德萬甜的批量檢測,可為食品監(jiān)管和執(zhí)法提供技術(shù)支撐和方法儲(chǔ)備,保障消費(fèi)者健康權(quán)益。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器與試劑

1290型超高效液相色譜-串聯(lián)6460型三重四極桿質(zhì)譜(美國Agilent公司), KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); CT140臺(tái)式高速離心機(jī)(上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司); Intergral 3超純水儀(德國Merck Millipore公司)。

愛德萬甜(含量≥97.0%, HPLC級(jí))購于美國SIGMA公司;安賽蜜(1.0 g/L)、赤蘚紅(1.0 g/L)購于北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司;糖精鈉(1.0 g/L)、日落黃(0.5 g/L)、胭脂紅(0.5 g/L)購于中國計(jì)量科學(xué)研究院;莧菜紅(0.5 mg/L)、新紅(0.5 g/L)購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所;苯甲酸(1.005 g/L)、山梨酸(1 g/L)、脫氫乙酸(含量為99.5%)、檸檬黃(含量為96.0%)、誘惑紅(含量為97.9%)、亮藍(lán)(含量為80.7%)、靛藍(lán)(含量為90.0%)購于北京曼哈格生物科技有限公司;甜蜜素(含量為99.9%)、阿斯巴甜(含量為96.4%)、對(duì)羥基苯甲酸甲酯(含量為99.9%)、對(duì)羥基苯甲酸乙酯(含量為99.9%)、對(duì)羥基苯甲酸丙酯(含量為99.5%)、對(duì)羥基苯甲酸丁酯(含量為99.9%)購于德國Dr Ehrenstorfer公司。

甲醇和乙腈(含量均≥99.9%,色譜純)購于德國Merck KGaA公司;乙酸銨(含量≥98.0%,分析純)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;冰乙酸(含量≥99.8%,色譜純)購于天津市化學(xué)試劑研究所有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2　配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

精確稱取愛德萬甜標(biāo)準(zhǔn)品50.00 mg,加入甲醇-水(50∶50, v/v)溶解,定容至100 mL[9],配制成質(zhì)量濃度為500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。臨用時(shí),用空白基質(zhì)溶液逐級(jí)稀釋至適當(dāng)濃度,待測。

取適量安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸丁酯、檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、新紅、赤蘚紅、亮藍(lán)、靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液加甲醇-水(50∶50, v/v)稀釋,定容至50 mL,配制成1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,待測。

1.3　前處理方法

飲料:精確稱取1.0 g樣品,加入甲醇-水(50∶50, v/v)混勻,定容至10 mL[10],以10 000 r/min的速度離心5 min,上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜,待測。

酸奶和果凍:精確稱取1.0 g樣品,加入8 mL甲醇-水(50∶50, v/v)溶液,超聲提取10 min,以10 000 r/min的速度離心5 min,取上清液于10 mL容量瓶中,加入甲醇-水(50∶50, v/v)混勻并定容至刻度,溶液過0.22 μm有機(jī)濾膜,待測。

1.4　色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱:Agilent SB-C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm);進(jìn)樣量:2 μL;柱溫:35 ℃;流速:0.4 mL/min;流動(dòng)相:A相為10 mmol/L乙酸銨溶液,B相為乙腈;流動(dòng)相梯度洗脫程序:0～1.00 min, 25%B; 1.00～3.00 min, 25%B～75%B; 3.00～5.00 min, 75%B; 5.01 min, 25%B;分析時(shí)間:10 min。

電噴霧離子源:正離子電離模式(ESI+);掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);毛細(xì)管電壓:4 kV;干燥氣(N2)溫度:350 ℃;干燥氣(N2)流速:10 mL/min;霧化氣(N2)壓力:3.4×105Pa。愛德萬甜母離子為m/z459,裂解電壓均為115 V;定性子離子為m/z459>252,碰撞能量為15 eV;定量子離子為m/z459>102,碰撞能量為25 eV。

2　結(jié)果與討論

2.1　色譜條件的優(yōu)化

愛德萬甜為中等極性化合物,采用C18色譜柱分離較合適,所以選用常用的Agilent SB-C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm)色譜柱對(duì)其進(jìn)行分離?？疾炝艘译?水(50∶50, v/v)和乙腈-0.01 mol/L乙酸銨(50∶50, v/v)兩種流動(dòng)相體系,發(fā)現(xiàn)采用后者為流動(dòng)相體系時(shí),目標(biāo)化合物的響應(yīng)低于前者,但后者能夠很好地改善峰形,使目標(biāo)化合物的峰形對(duì)稱且尖銳。同時(shí)對(duì)比了乙腈-0.01 mol/L乙酸銨(冰乙酸調(diào)pH至6.8)、乙腈-0.01 mol/L乙酸銨(冰乙酸調(diào)pH至5.0)、乙腈-0.01 mol/L乙酸銨(冰乙酸調(diào)pH至3.0)3種流動(dòng)相體系,發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間變化甚微,但隨著pH值降低,目標(biāo)化合物響應(yīng)值顯著下降(見圖1a)。為確保良好的峰形和較高的響應(yīng)值,最終選用乙腈-0.01 mol/L乙酸銨(pH=6.8)作為流動(dòng)相。

圖 1 　不同(a)pH和(b)體積比流動(dòng)相分離愛德萬甜的色譜圖Fig. 1 　Chromatograms of the advantame using mobile phases with different (a) pH and (b) proportions　　The pH values of acetonitrile-0.01 mol/L ammonium acetate (50∶50, v/v) were 6.8, 5.0, 3.0 for lines 1-3, respectively; acetonitrile-water (50∶50, v/v) for line 4. The volume ratios of acetonitrile-0.01 mol/L ammonium acetate (pH=6.8) were 45∶55, 40∶60, 35∶65, 30∶70, 25∶75 for lines 5-9, respectively; acetonitrile-0.01 mol/L ammonium acetate (pH=6.8) (gradient elution in part 1.4) for line 10.

考察了體積比為45∶55、40∶60、35∶65、30∶70和25∶75的乙腈-0.01 mol/L乙酸銨(pH=6.8)的流動(dòng)相等度洗脫對(duì)目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果顯示:目標(biāo)化合物的保留時(shí)間隨著有機(jī)相比例降低而延長,峰寬變寬,峰形變鈍,響應(yīng)值隨之變小。為得到合適的保留時(shí)間和響應(yīng)值,最終采用體積比為25∶75的乙腈-0.01 mol/L乙酸銨(pH=6.8)流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫(詳見1.4節(jié)),當(dāng)乙腈比例達(dá)到75%時(shí),得到了峰形窄而尖銳、響應(yīng)較高的愛德萬甜色譜圖(見圖1b)。

2.2　質(zhì)譜條件的優(yōu)化

愛德萬甜結(jié)構(gòu)式中有-COOH和-NH-基團(tuán),在質(zhì)譜分析中可能正離子電離模式和負(fù)離子電離模式均有一定的響應(yīng)。取質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的愛德萬甜溶液,分別在正離子模式和負(fù)離子模式下進(jìn)行條件優(yōu)化。采用負(fù)離子模式時(shí),目標(biāo)化合物響應(yīng)比正離子模式低得多,考慮目標(biāo)化合物在食品中的限量值較低,決定選用正離子電離模式分析。采用選擇離子監(jiān)測(SIM)模式對(duì)母離子[M+H]+(m/z459)進(jìn)行掃描,優(yōu)化裂解電壓(fragmentor)參數(shù)。施加優(yōu)化好的裂解電壓和不同的碰撞能量,采用子離子掃描(product ion scan)模式對(duì)子離子進(jìn)行掃描,得到3個(gè)相對(duì)豐度較高的特征碎片離子:m/z252、192和102。根據(jù)歐盟2002/657/EC規(guī)定,質(zhì)譜分析方法必須不少于4個(gè)識(shí)別點(diǎn),選取響應(yīng)較高的2對(duì)多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)離子對(duì)m/z459>252和459>102分別作為定性和定量離子,其可能裂解途徑見圖2,并選取優(yōu)化的碰撞能量參數(shù),以MRM模式對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

圖 2 　愛德萬甜的質(zhì)譜圖和可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig. 2 　Mass spectrogram and the proposed fragmen- tation pathways for advantame

2.3　基質(zhì)效應(yīng)(ME)評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中被分析物以外的化合物在分析過程中對(duì)目標(biāo)物有顯著干擾,并影響結(jié)果準(zhǔn)確性的現(xiàn)象。由于所測樣品基質(zhì)較復(fù)雜,建立的快速測定方法雖然采用甲醇-水(50∶50, v/v)提取溶液可以沉淀部分蛋白質(zhì),但未對(duì)樣品溶液進(jìn)行凈化處理,可能存在一定的基質(zhì)效應(yīng),所以采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率百分比來進(jìn)行評(píng)估[11,12]。分別配制質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.08、0.10、0.20、0.50、1.0和2.0 mg/L的溶劑(甲醇-水,50∶50, v/v)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液、飲料基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液、酸奶基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液、果凍基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,按優(yōu)化好的色譜質(zhì)譜條件測試,根據(jù)測試結(jié)果建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得的斜率按公式(1)來計(jì)算ME:

ME=a/b×100%

(1)

其中:a為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;b為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)ME>100%時(shí),基質(zhì)存在離子化增強(qiáng)作用;當(dāng)ME<100%時(shí);基質(zhì)存在離子化抑制作用。結(jié)果表明,飲料、酸奶和果凍的基質(zhì)效應(yīng)分別為107.0%、113.4%和105.7%,均存在離子化增強(qiáng)作用。雖然基質(zhì)效應(yīng)值在文獻(xiàn)報(bào)道的85%～115%內(nèi),但為了獲取更準(zhǔn)確的定性、定量結(jié)果,本文采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行分析。分別配制質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.08、0.10、0.20、0.50、1.0和2.0 mg/L的愛德萬甜基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行線性范圍測試。結(jié)果顯示,飲料、酸奶和果凍在0.01～1.0 mg/L均有良好的線性,相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.997,線性方程見表1。

表 1 　標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品溶液中愛德萬甜的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和基質(zhì)效應(yīng)

y: peak area,x: mass concentration, mg/L. /: no data.

2.4　檢出限、定量限和線性范圍

分別用飲料、酸奶和果凍空白樣品按照1.3節(jié)前處理方法處理后,分別用3種樣品溶液配制10.0 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用優(yōu)化好的色譜和質(zhì)譜條件分析。根據(jù)所測樣品溶液信噪比S/N≥3和S/N≥10計(jì)算檢出限和定量限。結(jié)果顯示,飲料、酸奶和果凍的愛德萬甜的方法檢出限均為0.03 mg/kg,定量限均為0.10 mg/kg。

2.5　回收率與精密度

分別稱取空白飲料、酸奶和果凍各18個(gè)樣品,每6個(gè)一組,分別添加低、中、高3個(gè)水平的愛德萬甜標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.3節(jié)前處理方法進(jìn)行處理,并進(jìn)行分析。結(jié)果(見表2)顯示,測定飲料、酸奶和果凍中愛德萬甜的回收率為80.3%～98.0%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.0%～7.0%(n=6),符合GB/T 28404-2008《實(shí)驗(yàn)室控制規(guī)范理化實(shí)驗(yàn)室》規(guī)定的要求,說明該方法有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表 2 　加標(biāo)飲料、酸奶和果凍中愛德萬甜的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

選取3個(gè)添加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的酸奶樣品進(jìn)行儀器精密度測試,分別測試6次。結(jié)果(見表3)表明,峰面積的RSD為1.83%～5.11%,保留時(shí)間的RSD小于0.2%(n=6),峰面積重復(fù)性和保留時(shí)間重復(fù)性均符合JJF 1317-2011《液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀校準(zhǔn)規(guī)范》規(guī)定的要求,說明儀器有良好的精密度。

表 3 　儀器的精密度測試(n=6)

2.6　干擾實(shí)驗(yàn)

根據(jù)GB 2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定,多種食品添加劑被允許添加至飲料、酸奶和果凍中,因此選取實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的甜味劑(安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜)、防腐劑(苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸丁酯)和合成著色劑(檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、新紅、赤蘚紅、亮藍(lán)、靛藍(lán))共20種食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,按1.3節(jié)色譜質(zhì)譜條件測定。結(jié)果(見圖3)表明,該20種食品添加劑均對(duì)愛德萬甜的測定無干擾,說明本方法具有良好的抗干擾能力和專一性。

圖 3 　干擾試驗(yàn)和實(shí)際樣品測定Fig. 3 　Interference experiment and determination of the real samples　a. beverage matrix standard solution (0.01 mg/L); b. yogurt matrix standard solution (0.01 mg/L); c. jelly matrix standard solution (0.01 mg/L); d. beverage blank solution; e. yogurt blank solution; f. jelly blank solution; g. 20-standard mixed solution (1.0 mg/L).

2.7　實(shí)際樣品測定

采用本文建立的方法對(duì)市售的6個(gè)飲料、6個(gè)酸奶和6個(gè)果凍樣品進(jìn)行了前處理,并采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行了檢測(見圖3),均未檢出愛德萬甜(<0.03 mg/kg),說明目前新品種甜味劑愛德萬甜還未在食品行業(yè)中廣泛應(yīng)用。

3　結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜快速測定食品中新品種甜味劑愛德萬甜的方法。以甲醇-水(50∶50, v/v)超聲提取樣品后,用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測,并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證和18個(gè)實(shí)際樣品的測定。該方法樣品處理簡單快速,抗干擾能力良好,準(zhǔn)確度和精密度較高,其定量限滿足國家標(biāo)準(zhǔn)限量要求,適用于食品中新品種甜味劑愛德萬甜的檢測,可為食品企業(yè)工藝改進(jìn)和出廠檢驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量把關(guān),也可為職能部門監(jiān)管食品中超范圍和超限量添加愛德萬甜提供技術(shù)支撐。