鄭亞麗,　顧麗莉*,　師君麗,　張夢曉,　孔光輝,李志君,　韓　毅,　彭　健

(1. 昆明理工大學化學工程學院, 云南 昆明 650500; 2. 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院, 云南 玉溪 653100)

煙草種植過程中使用農(nóng)藥以提高其產(chǎn)量和質(zhì)量,其中磺酰脲類除草劑因高效、廣譜、低毒等特點,已經(jīng)成為當今世界使用最廣泛的除草劑之一[1-3]。但是該類除草劑會長久地殘留在農(nóng)作物及其種植的土壤中。研究表明,吸食含有農(nóng)藥殘留煙葉制成的煙絲,會嚴重危害主動和被動吸食者的健康[4,5]。因此,各類農(nóng)藥殘留的精準檢測數(shù)據(jù)為煙草監(jiān)管和控制提供了重要依據(jù)。

為了確保大豆、稻谷等農(nóng)作物中的磺酰脲類農(nóng)藥殘留含量在食品安全允許范圍內(nèi)[6,7],國內(nèi)外研究者主要借助液相色譜及其聯(lián)用技術(shù)對其在生產(chǎn)過程中的含量進行檢測[8-10]。現(xiàn)階段該方法在磺酰脲類農(nóng)藥殘留檢測中遇到的主要問題是:預處理步驟繁瑣,基質(zhì)干擾嚴重,檢測效率受限[11-15]。故而,探索農(nóng)作物及土壤中磺酰脲類農(nóng)藥殘留的預處理方法具有重要的意義。同時,國內(nèi)外食品安全機構(gòu)往往會對多品種和類型的農(nóng)藥殘留進行檢測,因此單殘留的檢測方法已經(jīng)不能滿足實際需要。分子印跡聚合物具有選擇性高、穩(wěn)定性好、物理化學性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點,作為固相萃取材料,可從復雜基質(zhì)中分離富集目標分子及其結(jié)構(gòu)相似物,降低基質(zhì)的干擾,作為前處理手段,能提高分析精度和準確性[16-19]。因此本文利用分子印跡固相萃取法(MISPE)建立了同時檢測煙葉中氯磺隆、甲磺隆、芐嘧磺隆、苯磺隆、胺苯磺隆和煙嘧磺隆等6種磺酰脲類除草劑殘留的分析方法。實驗結(jié)果表明,該方法簡便、快速,凈化效果好,可以應用于實際煙葉樣品中磺酰脲類除草劑的檢測。

1　實驗部分

1.1　儀器、試劑與材料

Agilent 1100高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器(DAD))和Agilent Vac Elut 20固相萃取儀(安捷倫有限公司); VEGA 3 SBH掃描電子顯微鏡(SEM,泰斯肯貿(mào)易(上海)有限責任公司); Equinox55傅里葉紅外光譜儀(FT-IR,德國BRUKER); STA449F3熱重分析儀(德國耐馳); UV-1800PC紫外分光光度計(上海美普達儀器有限公司); Millipore Milli-Q Reference美國超純水儀(德國默克); RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠); Sartorius pp-25 pH計(德國賽多利斯); ZD-85氣浴恒溫振蕩器(金壇市城東新瑞儀器廠); Scilogex MX-S渦旋儀(北京科博賽爾科技有限公司); HK-1D恒溫水槽(南京南大萬和科技有限公司); BSA2245-CW電子天平(德國賽多利斯公司); KQ22000B超聲波清洗器(寧波海曙金達超聲波設備有限公司)。

氯磺隆(CS,純度99.0%)、甲磺隆(MSM,純度99.5%)、芐嘧磺隆(BSM,純度98%)、苯磺隆(TBM,純度99.5%)、胺苯磺隆(EMS,純度99.0%)、煙嘧磺隆(NS,純度99.0%)和異丙隆(IS,純度99.0%)購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;甲基丙烯酸(MAA)和偶氮二異丁腈(AIBN)購自天津市光復精細化工研究所,使用前已提純;三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)購自阿拉丁;二氯甲烷(DCM)、乙腈、無水甲醇、冰乙酸、丙酮、磷酸、正己烷均為國產(chǎn)分析純。

煙葉樣品為市售。

1.2　分子印跡聚合物微球的合成及SPE柱的制備

將0.2 mmol CS、0.8 mmol MAA和60 mL DCM放入100 mL硼硅酸玻璃瓶中,混合后于25 ℃恒溫振蕩預聚合4 h,再加入0.8 mmol TRIM和30 mg AIBN,繼續(xù)振蕩2 h。通氮氣10 min后密封玻璃瓶,于60 ℃恒溫反應24 h。將反應聚合物倒入培養(yǎng)皿干燥后進行索氏提取,用甲醇-乙酸(9∶1, v/v)重復洗脫該聚合物,直至上清液中檢測不到CS為止,再用甲醇洗滌殘留在聚合物上的乙酸至中性,最后用丙酮洗去雜物,將洗滌后的聚合物于50 ℃真空干燥至恒重,即得CS-MIP(chlorsulfuron molecularly imprinted polymers)。非分子印跡聚合物(NIP, non-molecularly imprinted polymers)的制備除了不加模板分子(CS)外,所有步驟同上。采用SEM及FT-IR對聚合物的形貌及結(jié)構(gòu)進行表征。

將100 mg CS-MIP和100 mg NIP分別裝入3 mL的空柱中,壓實并用0.45 μm濾膜支撐和限制填充物,制得MIP-SPE和NIP-SPE柱,待用。

1.3　標準溶液的配制

稱取CS、MSM、BSM、TBM、EMS、NS和IS標準物質(zhì)各20 mg分別置于100 mL容量瓶中,加入乙腈溶解后定容至刻度,即配制成200 mg/L的7種標準儲備溶液,置于4 ℃的冰箱中待用,使用時用乙腈稀釋成適當濃度的標準工作液。

1.4　樣品制備

將煙葉粉碎,準確稱取煙葉粉末2.00 g置于20 mL離心管中,加入10 mL二氯甲烷,渦旋振蕩3 min后超聲30 min,再高速離心10 min,過濾上清液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,將所得干燥樣品用1 mL乙腈溶解。

1.5　HPLC檢測條件

Agilent SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm,美國Agilent公司);柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL;流速:0.8 mL/min;檢測波長:241 nm。流動相A:乙腈-水(20∶80, v/v, 磷酸調(diào)pH為3);流動相B:乙腈-水(80∶20, v/v, 磷酸調(diào)pH為3);梯度洗脫:0 min(40%B)→8 min(40%B)→12 min(60%B)→17 min(70%B)→20 min(100%B)→22 min(100%B)→23 min(40%B)→28 min(40%B)。

1.6　聚合物微球的吸附特性

1.6.1動態(tài)吸附

準確稱取若干份等量的CS-MIP和NIP于20 mL離心管中,每份20 mg,各加入5 mL質(zhì)量濃度為5 mg/L的CS標準溶液,于室溫下恒溫振蕩進行吸附。按不同振蕩時間取出離心管,經(jīng)離心和過濾收集上清液,將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,所得干燥物用1 mL乙腈定容,并用1.5節(jié)方法定量檢測。由方程(1)計算分子印跡聚合物對模板分子的吸附量,重復3次取平均值。

(1)

式中Qi為單位質(zhì)量聚合物對目標分子i的吸附量(mg/g);C0,Ct分別為吸附初始和終止時目標分子在溶液中的質(zhì)量濃度(mg/L);V為標準溶液體積(L);m為CS-MIP或NIP的質(zhì)量(g)。

1.6.2選擇性吸附

本實驗選擇了模板分子(CS)、與CS結(jié)構(gòu)相似的磺酰脲類(MSM、BSM)和非磺酰脲類(IS)除草劑為目標分離物,分別測定CS-MIP與NIP對它們的飽和吸附量。準確稱取若干份等量的CS-MIP和NIP于20 mL離心管中,每份20 mg,各加入5 mL質(zhì)量濃度為5 mg/L的上述目標分離物的標準溶液,室溫下恒溫連續(xù)振蕩18 h,達到吸附平衡后,取出離心管,經(jīng)離心和過濾收集上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,乙腈復溶,用1.5節(jié)方法檢測目標分離物的濃度,由方程(1)計算聚合物對目標分子的飽和吸附量,實驗重復3次取平均值。

1.7　MIP-SPE條件

先用5 mL乙腈-二氯甲烷(1∶1, v/v)對MIP-SPE柱進行預活化,之后取0.5 mL CS標準溶液上樣,上樣溶劑為乙腈。然后用2 mL 正己烷淋洗小柱以除去非特異性干擾物,最后用5 mL甲醇-乙酸(9∶1, v/v)進行洗脫,收集洗脫液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,然后用1 mL乙腈定容,待測。

圖 1 　氯磺隆分子印跡聚合物的掃描電鏡圖Fig. 1 　Scanning electron microscopy (SEM) image of the prepared chlorsulfuron-molecularly imprinted polymers (CS-MIP)

2　結(jié)果與討論

2.1　分子印跡聚合物的表征

所制備的CS-MIP掃描電鏡形貌見圖1。從圖1可以看出,以二氯甲烷為致孔劑和聚合溶劑,在密閉反應裝置中沉淀聚合可得到分散性良好、顆粒均勻的聚合物微球。

圖2為CS-MIP及NIP的紅外光譜掃描結(jié)果;氯磺隆的紅外光譜圖參考Guo等[20]的文獻。從MIP洗脫前后及NIP的紅外光譜圖可看出,MIP洗脫前有4個明顯的特征吸收峰,3 245 cm-1處出現(xiàn)了-NH的伸縮振動,1 566 cm-1處出現(xiàn)了仲酰胺-NH的彎曲振動、1 364 cm-1處出現(xiàn)了磺酰胺-R-SO2-NH2-的極強吸收峰,759 cm-1處檢測到了C-H的彎曲振動,這4個吸收峰都是CS的紅外特征吸收峰,說明洗脫前的MIP中含有CS,而NIP與洗脫后的MIP中沒有CS。由此可知,模板分子CS被印跡在了MIP中,并且能夠被適當溶劑洗脫下來。

圖 2 　氯磺隆分子印跡聚合物與非分子印跡聚合物的紅外光譜圖Fig. 2 　Infrared spectra of the CS-MIP and non- molecularly imprinted polymers (NIP)　a. MIP before soxhlet extraction; b. MIP after soxhlet extraction; c. NIP.

2.2　聚合物的吸附特性

2.2.1動態(tài)吸附曲線

圖3為CS-MIP微球?qū)S的吸附量與時間的關系曲線。由圖3可知,CS-MIP的吸附量均大于NIP的,推測與分子印跡特定位點的吸附效應有關。從吸附開始至3 h,吸附量增加較為顯著,3 h之后,吸附量增加緩慢且趨于穩(wěn)定。

圖 3 　CS-MIP與NIP對CS的動態(tài)吸附曲線(n=3)Fig. 3 　Dynamic adsorption curves of the CS-MIP and NIP for CS (n=3)

圖 4 　CS-MIP與NIP對不同農(nóng)藥的選擇性吸附(n=3)Fig. 4 　Selective adsorption of the CS-MIP and NIP for different herbicides (n=3)　CS: chlorsulfuron; MSM: metsulfuron-methyl; BSM: bensulfuron-methyl; IS: isoproturon.

2.2.2選擇性吸附

CS-MIP和NIP對CS、MSM、BSM和IS的飽和吸附結(jié)果見圖4。CS-MIP對CS的吸附量是NIP的2.16倍,且明顯高于其他3種除草劑,說明CS-MIP對CS具有一定的選擇吸附特性。此外,CS-MIP對3種磺酰脲類除草劑(CS、MSM、BSM)的吸附量明顯大于NIP,而對非磺酰脲類除草劑(IS)的吸附量與NIP相當,說明CS-MIP對磺酰脲類除草劑具有特異吸附效應。

2.3　MIP-SPE條件的選擇

以模板分子CS為目標分離物,考察了乙腈和二氯甲烷作為上樣溶劑對分析的影響。結(jié)果表明,采用二氯甲烷時,HPLC檢測中會出現(xiàn)溶劑峰干擾,而采用乙腈時則不會,故選擇乙腈為上樣溶劑。

在收集樣品中模板分子或結(jié)構(gòu)相似物前,需要用弱極性淋洗劑溶解去除MIP-SPE柱中與其作用力較弱的雜質(zhì),同時盡量不溶出目標分離物。實驗以模板分子CS為目標分離物,考察了不同淋洗劑(正己烷、水、二氯甲烷、甲醇-水(1∶8, v/v)、甲醇-水(1∶6, v/v)以及甲醇-水(1∶4, v/v)(所用水的pH均用磷酸調(diào)為3))對氯磺隆回收率的影響,結(jié)果見圖5。結(jié)果表明,用2 mL正己烷作淋洗劑可減少煙葉中非特異性吸附的干擾,且對氯磺隆的回收率最高。因此,本實驗選擇正己烷為淋洗溶劑。

圖 5 　不同淋洗劑下氯磺隆的回收率Fig. 5 　Recoveries of CS with different washing solvents

2.4　SPE柱凈化效果的比較

圖6是含6種除草劑的煙葉樣品經(jīng)NIP-SPE柱或MIP-SPE柱凈化后得到的色譜圖,可以看出,圖6a存在較多基質(zhì)干擾,而圖6b中煙葉基質(zhì)干擾明顯降低，每個物質(zhì)峰清晰分開。進一步對圖6a和6b中6種除草劑的回收量進行計算，得出圖6b的回收量是圖6a的1.2～1.63倍?？梢姡琈IP-SPE柱提高了HPLC法對煙葉樣品中磺酰脲類除草劑檢測的靈敏度和準確性。

圖 6 　不同預處理條件下煙葉加標樣品中 6種磺酰脲類除草劑的色譜圖Fig. 6 　Chromatograms of tobacco samples spiked with six sulfonylurea herbicides using different pretreatment conditions　　a. purification by NIP-SPE; b. purification by MIP-SPE.　1. ethametsulfuron (EMS); 2. MSM; 3. CS; 4. nicosulfuron (NS); 5. BSM; 6. tribenuron-methyl (TBM).

2.5　線性方程和相關系數(shù)

準確移取1.3節(jié)中配制的標準儲備液于25 mL容量瓶中,用乙腈稀釋并定容,得到其質(zhì)量濃度分別為0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00和20.00 mg/L標準工作液,用1.5節(jié)方法檢測,每個樣品重復檢測5次,取其平均值。以質(zhì)量濃度為X,對應的峰面積為Y,繪制曲線,得到各物質(zhì)的線性回歸方程,6種物質(zhì)在此范圍內(nèi)呈良好的線性關系(r2=0.999 3～0.999 9)(見表1)。

表 1 　6種物質(zhì)的線性方程和相關系數(shù)(r2)

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L. Linear range: 0.1-20 mg/L.

2.6　回收率、精密度和檢出限

準確稱取4份干燥的煙葉粉末樣品,每份2.00 g,分別置于20 mL離心管中,向每份煙葉樣品中添加1 mL不同濃度的CS、MSM、BSM、TBM、EMS和NS 6種磺酰脲類除草劑混合標準溶液,4份煙葉樣品中每種除草劑的添加量都為0.50、5.0、30和50 μg/g。渦旋振蕩均質(zhì)5 min,靜置滲透24 h。上述每個水平的除草劑加標樣品均制作5份,做平行實驗。向裝有加標煙葉樣品的離心管中加入10 mL二氯甲烷,渦旋振蕩3 min后超聲30 min,再高速離心10 min,過濾上清液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,將所得干燥樣品用1 mL乙腈溶解,經(jīng)MIP-SPE柱固相萃取分離后用HPLC檢測,計算各種除草劑的回收率和檢測精密度,結(jié)果見表2。由表2可見,6種磺酰脲類除草劑在4個加標水平的平均回收率為77.60%～102.05%,相對標準偏差為0.16%～7.07%。6種除草劑的檢出限(S/N=3)為0.08～0.46 μg/g,定量限(S/N=10)為0.29～1.54 μg/g。

2.7　實際樣品檢測

采用本實驗建立的方法,將實際煙葉樣品經(jīng)CS-MIP-SPE前處理后,HPLC檢測,結(jié)果見圖7。所檢實際煙葉樣品中含有5種磺酰脲類農(nóng)藥殘留,分別為氯磺隆、芐嘧磺隆、苯磺隆、胺苯磺隆和煙嘧磺隆,其檢出量均低于定量限。

表 2 　煙葉樣品中6種磺酰脲類除草劑的加標回收率、相對標準偏差(n=5)、檢出限和定量限

圖 7 　煙葉樣品中磺酰脲類除草劑的色譜圖Fig. 7 　Chromatogram of sulfonylurea herbicides in a tobacco sample1. EMS; 3. CS; 4. NS; 5. BSM; 6. TBM.

3　結(jié)論

本文建立了分子印跡固相萃取-高效液相色譜同時檢測煙葉中的氯磺隆、甲磺隆、芐嘧磺隆、苯磺隆、胺苯磺隆和煙嘧磺隆等6種磺酰脲類除草劑殘留分析的方法,該方法簡便、快捷,能有效去除煙葉中復雜基質(zhì)的干擾,提高分析的精密度和準確性,可用于實際煙葉中多種磺酰脲類除草劑的檢測,同時也為其他農(nóng)作物及土壤中磺酰脲類多種農(nóng)藥殘留提供了技術(shù)支撐。