周　鵬,　黃　芊,　歐陽立群,　王　征,　孟　鵬,　戴　明*,　王　瑛

(1. 南京理工大學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 南京 210094; 2. 國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(福州), 福建 福州 350002)

2017年8月初,荷蘭被爆出“毒雞蛋”事件,這是近年來少有的波及全球的食品安全問題,也使得氟蟲腈成為世人矚目的焦點。氟蟲腈為苯基吡唑類殺蟲劑,對昆蟲有胃毒作用,能夠有效殺死跳蚤、虱子等生物,被世界衛(wèi)生組織列為“對人類有中度毒性”的化學(xué)品,但其對甲殼類水生生物和蜜蜂具有較高毒性,并且在水和土壤中降解緩慢[1-3]。我國規(guī)定自2009年10月1日起,除衛(wèi)生用、玉米等部分旱田種子包衣劑外,在我國境內(nèi)停止銷售和使用用于其他方面的含氟蟲腈成分的農(nóng)藥制劑[4]。

目前世界多個國家和組織制定了雞蛋中氟蟲腈總量(氟蟲腈及其代謝物)的最大標(biāo)準(zhǔn)限量(MRL),但我國最新的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763-2016)中沒有規(guī)定雞蛋的最大殘留限量值,規(guī)定了玉米中氟蟲腈的最大殘留限量值為0.1 mg/kg[5]。飼料中過高含量的氟蟲腈會在動物體內(nèi)蓄積,導(dǎo)致動物源性食品中氟蟲腈含量超標(biāo),危害消費者健康。在毒雞蛋事件爆發(fā)以后,農(nóng)業(yè)部連發(fā)《農(nóng)業(yè)部辦公廳關(guān)于切實加強農(nóng)藥使用指導(dǎo)和市場監(jiān)管的通知》《農(nóng)業(yè)部辦公廳關(guān)于切實加強蛋禽養(yǎng)殖質(zhì)量安全管理工作的通知》等通知,要求嚴(yán)格管理氟蟲腈,嚴(yán)防氟蟲腈在生產(chǎn)經(jīng)營各環(huán)節(jié)對飼料原料和產(chǎn)品造成污染,嚴(yán)禁將氟蟲腈作為獸藥經(jīng)營和使用。

目前針對氟蟲腈及其代謝物的測定主要集中在蔬菜、水果、茶葉以及近期研究較多的禽蛋及蛋制品方面,測定方法主要包括氣相色譜法(GC)[6-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[10-14]以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[15-18]等。但是目前國內(nèi)還沒有針對飼料中氟蟲腈含量測定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),也未見相關(guān)的文獻報道,給產(chǎn)品檢驗、風(fēng)險排查與控制帶來了諸多不便。

本研究采用QuEChERS凈化法進行樣品前處理,建立了飼料中氟蟲腈及其代謝物殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,為政府的日常監(jiān)管、養(yǎng)殖者的風(fēng)險控制提供了有力的技術(shù)支持。

1　實驗部分

1.1　儀器、試劑與材料

Sciex 4500 QTrap四極桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜儀(美國Sciex公司),配LC-30A高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司); Milli-Q超純水發(fā)生器(美國Millipore公司); DTC-27J超聲波清洗機(湖北鼎泰生化科技設(shè)備制造有限公司); MS 3 Basic渦旋混合器(德國IKA公司); Multifuge X3R離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈砜(純度>98%)購自農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境保護科研監(jiān)測所;氟蟲腈同位素內(nèi)標(biāo)(13C215N2-氟蟲腈)購自北京振祥科技有限公司;甲醇、乙腈(色譜純)購自德國Merck公司;C18粉、石墨化炭黑(GCB)、N-丙基乙二胺(PSA)購自美國Agilent公司;中性氧化鋁(Al2O3, 100～200目)、氯化鈉(分析純)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;0.2 μm聚四氟乙烯(PTFE)微孔濾膜購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

分別準(zhǔn)確稱取適量氟蟲腈及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品和氟蟲腈內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品,置于10 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容,配制質(zhì)量濃度為500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-18 ℃避光保存。準(zhǔn)確移取適量上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液,根據(jù)需要用乙腈逐級稀釋,配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液(含氟蟲腈內(nèi)標(biāo)2.0 μg/L),現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2　樣品前處理

飼料樣品經(jīng)粉碎均勻后制成待測樣,于室溫下密封保存。準(zhǔn)確稱取粉碎樣品2 g(精確到0.01 g),置于50 mL具塞離心管中,加入20 μL氟蟲腈內(nèi)標(biāo)(1.0 mg/L)和10 mL純水,渦旋混勻,加入10.0 mL乙腈,混勻,超聲提取30 min,加入2 g氯化鈉,劇烈振蕩1 min,以10 000 r/min高速離心5 min;移取上清液1.0 mL,轉(zhuǎn)入2 mL QuEChERS凈化管(含有50 mg GCB、50 mg PSA和50 mg Al2O3)中,渦旋振蕩1 min,以16 000 r/min離心3 min,上清液用0.2 μm PTFE濾膜過濾,待測。

1.3　色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱:Waters HSS T3 C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫40 ℃;流動相:A為純水,B為甲醇;流速:0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～4.0 min, 60%B～90%B; 4.0～5.5 min, 90%B; 5.5～7.0 min, 60%B。進樣量:5 μL。

離子源:電噴霧電離(ESI)源,負(fù)離子模式:多反應(yīng)監(jiān)測模式;電噴霧電壓:4 500 V;氣簾氣壓力:0.21 MPa;霧化氣壓力:0.38 MPa;輔助氣壓力:0.38 MPa;輔助氣溫度:550 ℃。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2　結(jié)果與討論

2.1　色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取200 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用流動注射泵直接注入質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。實驗發(fā)現(xiàn)，氟蟲腈及其代謝物在正、負(fù)離子模式下均有響應(yīng),這主要是因為它們都有氨基,既可以得到一個質(zhì)子形成[M+H]+,也可以失去一個質(zhì)子形成[M-H]-,但是在負(fù)離子模式下干擾較小,信噪比更高,因此本研究采用負(fù)離子模式。在負(fù)離子模式下,對氟蟲腈及其代謝物進行母離子掃描,選擇[M-H]-離子作為母離子,確定母離子后進行子離子掃描,選擇最高響應(yīng)的子離子作為定量離子,響應(yīng)次高的子離子作為定性離子,再對每個離子對的去簇電壓及碰撞能量進行優(yōu)化,得到最優(yōu)質(zhì)譜參數(shù)(見表1)。氟蟲腈及其代謝物的二級質(zhì)譜圖見圖1。

表 1 　氟蟲腈及其代謝物和氟蟲腈內(nèi)標(biāo)的監(jiān)測離子對、去簇電壓和碰撞能量

* Quantitative ion.

圖 1 　氟蟲腈及其代謝物的質(zhì)譜圖Fig. 1 　Mass spectra of fipronil and its metabolites

實驗考察了水-甲醇、水-乙腈、10 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇等4種流動相體系對色譜峰峰形及響應(yīng)的影響。結(jié)果顯示,4種體系均能獲得較好的色譜峰形,但是采用水-甲醇體系時目標(biāo)化合物的響應(yīng)值最大,靈敏度最高。因此本研究采用水-甲醇作為流動相。

2.2　前處理條件的優(yōu)化

飼料是一類相當(dāng)復(fù)雜的樣品,不僅含有玉米、豆粕等植物源性原料,還含有魚粉、骨粉、羽毛粉等多種動物源性原料,同時為了提高飼料回報率還要添加大量的礦物質(zhì)元素、維生素、氨基酸以及各種植物提取液,甚至部分種類的抗生素和促生長激素,這使得一些在植物源性食品或動物源性食品中已較為成熟的分析方法無法直接應(yīng)用到飼料樣品的分析中。

與經(jīng)典的固相萃取技術(shù)相比,QuEChERS凈化法具有使用方便、成本低、效率高、試劑用量小、環(huán)境友好等特點,越來越多地被分析工作者使用。實驗分別采用50 mg中性氧化鋁、PSA、GCB以及C18粉等幾種常用的吸附劑考察其對目標(biāo)化合物的吸附能力。結(jié)果表明,4種吸附劑對氟蟲腈及其代謝物的吸附率極低,回收率可達95.4%～102.6%。

采用液相色譜-質(zhì)譜分析時普遍存在基質(zhì)效應(yīng)(ME), ME是影響靈敏度、準(zhǔn)確度的主要因素之一,樣品前處理的主要目的就是盡可能地降低ME對測量結(jié)果的影響。實驗采用未凈化的空白樣品提取液以及經(jīng)上述4種吸附劑凈化后的空白樣品提取液配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,同時采用乙腈配制試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液。通過ME=(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積/試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積-1)×100%的計算方法考察凈化前及采用不同吸附劑凈化后的基質(zhì)效應(yīng)。

當(dāng)ME為0時表示無基質(zhì)效應(yīng),ME為負(fù)值時表示存在離子化抑制效應(yīng),ME為正值時表示存在離子化增強效應(yīng);ME越偏離0,表示基質(zhì)效應(yīng)越顯著。實驗結(jié)果表明:未凈化前具有很強的離子化抑制效應(yīng),ME為-42.1%～-64.0%; C18、GCB降低基質(zhì)效應(yīng)效果不明顯,ME分別為-34.0%～-60.1%和-39.6%～-58.8%; Al2O3與PSA對于降低基質(zhì)效應(yīng)具有較好的效果,ME分別為-22.5%～-26.6%和-22.6%～24.6%(見表2)。

實驗又比較了不同含量Al2O3與PSA混合材料的凈化效果,結(jié)果表明,采用50 mg PSA與50 mg Al2O3混合凈化材料可進一步降低基質(zhì)效應(yīng),具有較好的凈化效果。雖然GCB在降低基質(zhì)效應(yīng)上無顯著效果,但是可以吸附各種色素,有利于延長色譜柱的使用壽命,因此最終分別采用50 mg Al2O3、PSA與GCB作為凈化材料。

表 2 　不同吸附劑凈化前、后氟蟲腈及其代謝物的基質(zhì)效應(yīng)(n=5)

PSA: primary secondary amine; GCB: graphitized carbon black.

2.3　方法學(xué)評價

在1.3節(jié)條件下對系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進行測定,采用內(nèi)標(biāo)法定量,以目標(biāo)化合物與內(nèi)標(biāo)定量離子對的峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y)、對應(yīng)的質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo)(X)進行線性回歸,4種目標(biāo)化合物在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)>0.999 8。用空白樣品提取液配制適當(dāng)濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后在1.3節(jié)條件下進行測定,以3倍和10倍信噪比確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),詳見表3。

表 3 　氟蟲腈及其代謝物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

Y: peak area ratio of the compound to the internal standard;X: mass concentration ratio of the compound to the internal standard.

表 4 　飼料中氟蟲腈及其代謝物的回收率與精密度(n=5)

選取空白飼料樣品,分別加入高、中、低3個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個水平平行測定5次,考察方法的回收率和精密度。氟蟲腈及其代謝物的加標(biāo)回收率為92.3%～105.4%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～2.3%,詳見表4。

2.4　實際樣品分析

采用本研究建立的分析方法對市售的24批次不同來源的飼料樣品進行檢測,其中15批次飼料樣品檢出氟蟲腈,含量為0.24～1.73 μg/kg; 6批次飼料樣品檢出氟蟲腈砜,含量為0.21～0.29 μg/kg; 1批次飼料樣品檢出氟蟲腈亞砜,含量為0.29 μg/kg; 1批次飼料樣品檢出氟甲腈,含量為0.41 μg/kg。由此可見,飼料中氟蟲腈及其代謝物的檢出率較高,需引起監(jiān)管部門的重視。

3　結(jié)論

本研究建立了QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定飼料中氟蟲腈及其代謝物殘留量的分析方法。該方法靈敏度高,凈化效果好,操作簡單,精密度、準(zhǔn)確度高,適用于大批量樣本中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定。