周　鵬,　黃　芊,　歐陽(yáng)立群,　王　征,　孟　鵬,　戴　明*,　王　瑛

(1. 南京理工大學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 南京 210094; 2. 國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(福州), 福建 福州 350002)

2017年8月初,荷蘭被爆出“毒雞蛋”事件,這是近年來(lái)少有的波及全球的食品安全問(wèn)題,也使得氟蟲(chóng)腈成為世人矚目的焦點(diǎn)。氟蟲(chóng)腈為苯基吡唑類(lèi)殺蟲(chóng)劑,對(duì)昆蟲(chóng)有胃毒作用,能夠有效殺死跳蚤、虱子等生物,被世界衛(wèi)生組織列為“對(duì)人類(lèi)有中度毒性”的化學(xué)品,但其對(duì)甲殼類(lèi)水生生物和蜜蜂具有較高毒性,并且在水和土壤中降解緩慢[1-3]。我國(guó)規(guī)定自2009年10月1日起,除衛(wèi)生用、玉米等部分旱田種子包衣劑外,在我國(guó)境內(nèi)停止銷(xiāo)售和使用用于其他方面的含氟蟲(chóng)腈成分的農(nóng)藥制劑[4]。

目前世界多個(gè)國(guó)家和組織制定了雞蛋中氟蟲(chóng)腈總量(氟蟲(chóng)腈及其代謝物)的最大標(biāo)準(zhǔn)限量(MRL),但我國(guó)最新的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763-2016)中沒(méi)有規(guī)定雞蛋的最大殘留限量值,規(guī)定了玉米中氟蟲(chóng)腈的最大殘留限量值為0.1 mg/kg[5]。飼料中過(guò)高含量的氟蟲(chóng)腈會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)蓄積,導(dǎo)致動(dòng)物源性食品中氟蟲(chóng)腈含量超標(biāo),危害消費(fèi)者健康。在毒雞蛋事件爆發(fā)以后,農(nóng)業(yè)部連發(fā)《農(nóng)業(yè)部辦公廳關(guān)于切實(shí)加強(qiáng)農(nóng)藥使用指導(dǎo)和市場(chǎng)監(jiān)管的通知》《農(nóng)業(yè)部辦公廳關(guān)于切實(shí)加強(qiáng)蛋禽養(yǎng)殖質(zhì)量安全管理工作的通知》等通知,要求嚴(yán)格管理氟蟲(chóng)腈,嚴(yán)防氟蟲(chóng)腈在生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)各環(huán)節(jié)對(duì)飼料原料和產(chǎn)品造成污染,嚴(yán)禁將氟蟲(chóng)腈作為獸藥經(jīng)營(yíng)和使用。

目前針對(duì)氟蟲(chóng)腈及其代謝物的測(cè)定主要集中在蔬菜、水果、茶葉以及近期研究較多的禽蛋及蛋制品方面,測(cè)定方法主要包括氣相色譜法(GC)[6-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[10-14]以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[15-18]等。但是目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有針對(duì)飼料中氟蟲(chóng)腈含量測(cè)定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),也未見(jiàn)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道,給產(chǎn)品檢驗(yàn)、風(fēng)險(xiǎn)排查與控制帶來(lái)了諸多不便。

本研究采用QuEChERS凈化法進(jìn)行樣品前處理,建立了飼料中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,為政府的日常監(jiān)管、養(yǎng)殖者的風(fēng)險(xiǎn)控制提供了有力的技術(shù)支持。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器、試劑與材料

Sciex 4500 QTrap四極桿串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜儀(美國(guó)Sciex公司),配LC-30A高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司); Milli-Q超純水發(fā)生器(美國(guó)Millipore公司); DTC-27J超聲波清洗機(jī)(湖北鼎泰生化科技設(shè)備制造有限公司); MS 3 Basic渦旋混合器(德國(guó)IKA公司); Multifuge X3R離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。

氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈亞砜、氟蟲(chóng)腈砜(純度>98%)購(gòu)自農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所;氟蟲(chóng)腈同位素內(nèi)標(biāo)(13C215N2-氟蟲(chóng)腈)購(gòu)自北京振祥科技有限公司;甲醇、乙腈(色譜純)購(gòu)自德國(guó)Merck公司;C18粉、石墨化炭黑(GCB)、N-丙基乙二胺(PSA)購(gòu)自美國(guó)Agilent公司;中性氧化鋁(Al2O3, 100～200目)、氯化鈉(分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;0.2 μm聚四氟乙烯(PTFE)微孔濾膜購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

分別準(zhǔn)確稱取適量氟蟲(chóng)腈及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品和氟蟲(chóng)腈內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品,置于10 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容,配制質(zhì)量濃度為500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-18 ℃避光保存。準(zhǔn)確移取適量上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,根據(jù)需要用乙腈逐級(jí)稀釋,配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液(含氟蟲(chóng)腈內(nèi)標(biāo)2.0 μg/L),現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2　樣品前處理

飼料樣品經(jīng)粉碎均勻后制成待測(cè)樣,于室溫下密封保存。準(zhǔn)確稱取粉碎樣品2 g(精確到0.01 g),置于50 mL具塞離心管中,加入20 μL氟蟲(chóng)腈內(nèi)標(biāo)(1.0 mg/L)和10 mL純水,渦旋混勻,加入10.0 mL乙腈,混勻,超聲提取30 min,加入2 g氯化鈉,劇烈振蕩1 min,以10 000 r/min高速離心5 min;移取上清液1.0 mL,轉(zhuǎn)入2 mL QuEChERS凈化管(含有50 mg GCB、50 mg PSA和50 mg Al2O3)中,渦旋振蕩1 min,以16 000 r/min離心3 min,上清液用0.2 μm PTFE濾膜過(guò)濾,待測(cè)。

1.3　色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱:Waters HSS T3 C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫40 ℃;流動(dòng)相:A為純水,B為甲醇;流速:0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～4.0 min, 60%B～90%B; 4.0～5.5 min, 90%B; 5.5～7.0 min, 60%B。進(jìn)樣量:5 μL。

離子源:電噴霧電離(ESI)源,負(fù)離子模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式;電噴霧電壓:4 500 V;氣簾氣壓力:0.21 MPa;霧化氣壓力:0.38 MPa;輔助氣壓力:0.38 MPa;輔助氣溫度:550 ℃。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2　結(jié)果與討論

2.1　色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取200 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用流動(dòng)注射泵直接注入質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氟蟲(chóng)腈及其代謝物在正、負(fù)離子模式下均有響應(yīng),這主要是因?yàn)樗鼈兌加邪被?既可以得到一個(gè)質(zhì)子形成[M+H]+,也可以失去一個(gè)質(zhì)子形成[M-H]-,但是在負(fù)離子模式下干擾較小,信噪比更高,因此本研究采用負(fù)離子模式。在負(fù)離子模式下,對(duì)氟蟲(chóng)腈及其代謝物進(jìn)行母離子掃描,選擇[M-H]-離子作為母離子,確定母離子后進(jìn)行子離子掃描,選擇最高響應(yīng)的子離子作為定量離子,響應(yīng)次高的子離子作為定性離子,再對(duì)每個(gè)離子對(duì)的去簇電壓及碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化,得到最優(yōu)質(zhì)譜參數(shù)(見(jiàn)表1)。氟蟲(chóng)腈及其代謝物的二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

表 1 　氟蟲(chóng)腈及其代謝物和氟蟲(chóng)腈內(nèi)標(biāo)的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓和碰撞能量

* Quantitative ion.

圖 1 　氟蟲(chóng)腈及其代謝物的質(zhì)譜圖Fig. 1 　Mass spectra of fipronil and its metabolites

實(shí)驗(yàn)考察了水-甲醇、水-乙腈、10 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇等4種流動(dòng)相體系對(duì)色譜峰峰形及響應(yīng)的影響。結(jié)果顯示,4種體系均能獲得較好的色譜峰形,但是采用水-甲醇體系時(shí)目標(biāo)化合物的響應(yīng)值最大,靈敏度最高。因此本研究采用水-甲醇作為流動(dòng)相。

2.2　前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

飼料是一類(lèi)相當(dāng)復(fù)雜的樣品,不僅含有玉米、豆粕等植物源性原料,還含有魚(yú)粉、骨粉、羽毛粉等多種動(dòng)物源性原料,同時(shí)為了提高飼料回報(bào)率還要添加大量的礦物質(zhì)元素、維生素、氨基酸以及各種植物提取液,甚至部分種類(lèi)的抗生素和促生長(zhǎng)激素,這使得一些在植物源性食品或動(dòng)物源性食品中已較為成熟的分析方法無(wú)法直接應(yīng)用到飼料樣品的分析中。

與經(jīng)典的固相萃取技術(shù)相比,QuEChERS凈化法具有使用方便、成本低、效率高、試劑用量小、環(huán)境友好等特點(diǎn),越來(lái)越多地被分析工作者使用。實(shí)驗(yàn)分別采用50 mg中性氧化鋁、PSA、GCB以及C18粉等幾種常用的吸附劑考察其對(duì)目標(biāo)化合物的吸附能力。結(jié)果表明,4種吸附劑對(duì)氟蟲(chóng)腈及其代謝物的吸附率極低,回收率可達(dá)95.4%～102.6%。

采用液相色譜-質(zhì)譜分析時(shí)普遍存在基質(zhì)效應(yīng)(ME), ME是影響靈敏度、準(zhǔn)確度的主要因素之一,樣品前處理的主要目的就是盡可能地降低ME對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)采用未凈化的空白樣品提取液以及經(jīng)上述4種吸附劑凈化后的空白樣品提取液配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,同時(shí)采用乙腈配制試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液。通過(guò)ME=(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積/試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積-1)×100%的計(jì)算方法考察凈化前及采用不同吸附劑凈化后的基質(zhì)效應(yīng)。

當(dāng)ME為0時(shí)表示無(wú)基質(zhì)效應(yīng),ME為負(fù)值時(shí)表示存在離子化抑制效應(yīng),ME為正值時(shí)表示存在離子化增強(qiáng)效應(yīng);ME越偏離0,表示基質(zhì)效應(yīng)越顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:未凈化前具有很強(qiáng)的離子化抑制效應(yīng),ME為-42.1%～-64.0%; C18、GCB降低基質(zhì)效應(yīng)效果不明顯,ME分別為-34.0%～-60.1%和-39.6%～-58.8%; Al2O3與PSA對(duì)于降低基質(zhì)效應(yīng)具有較好的效果,ME分別為-22.5%～-26.6%和-22.6%～24.6%(見(jiàn)表2)。

實(shí)驗(yàn)又比較了不同含量Al2O3與PSA混合材料的凈化效果,結(jié)果表明,采用50 mg PSA與50 mg Al2O3混合凈化材料可進(jìn)一步降低基質(zhì)效應(yīng),具有較好的凈化效果。雖然GCB在降低基質(zhì)效應(yīng)上無(wú)顯著效果,但是可以吸附各種色素,有利于延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命,因此最終分別采用50 mg Al2O3、PSA與GCB作為凈化材料。

表 2 　不同吸附劑凈化前、后氟蟲(chóng)腈及其代謝物的基質(zhì)效應(yīng)(n=5)

PSA: primary secondary amine; GCB: graphitized carbon black.

2.3　方法學(xué)評(píng)價(jià)

在1.3節(jié)條件下對(duì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定,采用內(nèi)標(biāo)法定量,以目標(biāo)化合物與內(nèi)標(biāo)定量離子對(duì)的峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y)、對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸,4種目標(biāo)化合物在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)>0.999 8。用空白樣品提取液配制適當(dāng)濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后在1.3節(jié)條件下進(jìn)行測(cè)定,以3倍和10倍信噪比確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),詳見(jiàn)表3。

表 3 　氟蟲(chóng)腈及其代謝物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

Y: peak area ratio of the compound to the internal standard;X: mass concentration ratio of the compound to the internal standard.

表 4 　飼料中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的回收率與精密度(n=5)

選取空白飼料樣品,分別加入高、中、低3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)水平平行測(cè)定5次,考察方法的回收率和精密度。氟蟲(chóng)腈及其代謝物的加標(biāo)回收率為92.3%～105.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～2.3%,詳見(jiàn)表4。

2.4　實(shí)際樣品分析

采用本研究建立的分析方法對(duì)市售的24批次不同來(lái)源的飼料樣品進(jìn)行檢測(cè),其中15批次飼料樣品檢出氟蟲(chóng)腈,含量為0.24～1.73 μg/kg; 6批次飼料樣品檢出氟蟲(chóng)腈砜,含量為0.21～0.29 μg/kg; 1批次飼料樣品檢出氟蟲(chóng)腈亞砜,含量為0.29 μg/kg; 1批次飼料樣品檢出氟甲腈,含量為0.41 μg/kg。由此可見(jiàn),飼料中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的檢出率較高,需引起監(jiān)管部門(mén)的重視。

3　結(jié)論

本研究建立了QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定飼料中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留量的分析方法。該方法靈敏度高,凈化效果好,操作簡(jiǎn)單,精密度、準(zhǔn)確度高,適用于大批量樣本中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留量的測(cè)定。