汪　耀,　梁高道,　韓　清,　胡　迅,　張啟偉,　何振宇*

(1. 武漢市疾病預(yù)防控制中心, 湖北 武漢 430015; 2. 江漢大學(xué), 湖北 武漢 430056)

單克隆抗體(單抗)藥物因具有特異性強、見效快、副作用小等優(yōu)點,已成為當(dāng)下治療癌癥和自身免疫疾病等多種高危疾病的有效藥物[1]。作為重要的生物藥物,單抗的活性和安全性主要由其氨基酸序列決定,但同時也受到轉(zhuǎn)錄后修飾的顯著影響。常見的轉(zhuǎn)錄后修飾包括脫酰胺、氧化、二硫鍵連接、糖基化等,其中以糖基化最復(fù)雜、最重要[2]。糖基化影響藥物的溶解性、穩(wěn)定性、藥代動力學(xué)、生物活性和安全性等[3],是單抗的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一,受到特別關(guān)注[4,5]。鑒于糖基化對于生物藥物存在重要意義,如何對其進行詳細表征及功能分析已成為當(dāng)前生物、制藥、臨床醫(yī)學(xué)等研究方向的熱點和難點之一。

幾乎所有的單抗都含有N-糖,對單抗的結(jié)構(gòu)和功能有著重要影響,對N-糖的表征是最重要、最廣泛的單抗糖基化研究內(nèi)容之一。有綜述[6]對當(dāng)前的單抗藥物糖基化修飾分析技術(shù)進行了總結(jié),主要包括高效液相色譜[7,8]、毛細管電泳[9]、基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜[10]、液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用[11,12]等。其中,N-糖還原胺化衍生后通過LC-MS系統(tǒng)在正離子模式下進行表征已經(jīng)成為生物制藥企業(yè)普遍采用的方法。此方法的優(yōu)勢在于能夠通過熒光檢測器對樣品進行相對定量分析,較為穩(wěn)定可靠。但也存在一些缺陷:第一,唾液酸殘基在正離子模式下電離效率低,結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,導(dǎo)致酸性糖的檢測靈敏度較低;第二,流動相使用的甲酸銨溶液濃度較高,容易在質(zhì)譜錐孔和離子傳輸毛細管等處堆積,從而污染儀器;第三,親水相互作用色譜(HILIC)柱壽命較短,難以長期保持譜圖的重現(xiàn)性,增加了實驗的復(fù)雜性和使用成本等。第一個和第二個缺陷均與還原胺化衍生相關(guān),采用其他衍生方法代替還原胺化有望解決該問題。還原胺化N-糖的色譜分離經(jīng)常依賴含鹽流動相,以便獲得較好的色譜分離度,如果要避免使用含鹽流動相,則替換衍生方法是可行的方案之一。第三個缺陷主要與色譜柱材料相關(guān),可使用結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定的色譜柱代替HILIC柱。

為了克服經(jīng)典方法的三大缺陷,本文嘗試用新的方法分析單抗的N-糖基化。通過甲胺化衍生穩(wěn)定唾液酸殘基,增強酸性糖的質(zhì)譜電離效率,采用結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定的基于硅氫化物固定相的正相色譜(SiH-NPC)柱代替HILIC柱,以降低實驗成本。此方法為單抗糖基化的表征提供了新的分析策略,在生物制藥行業(yè)具有重要的應(yīng)用前景。

1　實驗部分

1.1　設(shè)備與試劑

UPLC-MS(ACQUITY UPLC和Xevo G2-XS QTOF,美國Waters公司),真空離心濃縮儀(德國Eppendorf公司), Milli-Q純水儀(美國Millipore公司)。HILIC柱(TSKgel Amide-80, 250 mm×4.6 mm, 5.0 μm)購自日本東曹株式會社;硅氫化物色譜柱(Cogent Silica-C, 250 mm×4.6 mm, 5.0 μm)購自美國MicroSolv公司。

2-氨基苯甲酸(2-AA)、氰基硼氫化鈉、甲酸銨、二甲基亞砜(DMSO)、甲胺鹽酸鹽、甲基嗎啉、六氟磷酸(7-氮雜苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷磷(PyAOP)、多孔石墨化碳(PGC)、微晶纖維素(MCC)、硼烷氨絡(luò)合物(BAC)均為分析純,購自美國Sigma-Aldrich公司;5×105units/mL肽N-糖苷酶F(PNGase F)及糖苷內(nèi)切酶緩沖液試劑盒(EBP)購自美國New England Biolabs公司;乙酸(HAc)、三氟乙酸(TFA)、乙腈、甲醇、甲酸(FA)均為優(yōu)級純,購自美國Thermo Fisher Scientific公司;單克隆抗體藥物(5 g/L)由人福醫(yī)藥集團股份公司友情提供。

1.2　樣品前處理

1.2.1N-糖解離

N-糖與蛋白質(zhì)的天冬酰胺殘基相連,需要將其從單抗分子上解離后再進行分析,解離方法參考文獻[13]:取10 μL單抗溶液(相當(dāng)于100 μg樣品)與90 μL蛋白質(zhì)變性緩沖液混合,于沸水中加熱10 min;冷卻后加入12 μL 10%(質(zhì)量體積分數(shù))NP-40溶液(來自于EBP試劑盒)和5 unit PNGase F酶,于37 ℃水浴過夜,用真空離心濃縮儀干燥。

1.2.2N-糖純化

酶切后的樣品溶于0.5 mL 5%(體積分數(shù),下同)乙腈(含0.1%TFA)中,通過PGC固相萃取小柱純化N-糖[14]。先用2 mL乙腈和2 mL 15%乙腈(含0.1% TFA)清洗PGC小柱,然后用3 mL 5%乙腈(含0.1% TFA)平衡小柱;上樣后用3 mL 5%乙腈(含0.1% TFA)沖洗小柱;再用1.2 mL 40%乙腈(含0.1% TFA)洗脫樣品,回收洗脫液,于真空離心濃縮儀中干燥。

1.2.3N-糖還原胺化衍生

以2-AA作為N-糖的還原胺化衍生試劑,衍生方法參考文獻[15]。用DMSO/HAc(7∶3, v/v)配制100 g/L氰基硼氫化鈉和50 g/L 2-AA混合溶液,取20 μL該混合溶液加入樣品中,于65 ℃放置2.5 h后完成衍生反應(yīng)。

1.2.4N-糖甲胺化衍生

N-糖的甲胺化衍生方法參考文獻[16]。干燥的樣品與25 μL衍生試劑(含1 mol/L甲胺鹽酸鹽溶液和0.5 mol/L甲基嗎啉溶液,溶劑為DMSO)和25 μL的PyAOP溶液(溶劑為DMSO)混合,于常溫避光靜置30 min。本研究小組[17]之前報道過,對于單唾液酸化和二唾液酸化的N-糖而言,甲胺化衍生效率約為95%。

1.2.5衍生后N-糖純化

還原胺化和甲胺化的樣品均可通過MCC固相萃取小柱純化[18]。先用2 mL水清洗MCC小柱,然后用3 mL 80%乙腈(含3% FA)平衡小柱;上樣后用3 mL 80%乙腈(含3% FA)沖洗小柱;再用1.2 mL 5%乙腈洗脫樣品,回收洗脫液并于真空離心濃縮儀中干燥。

1.2.6甲胺化N-糖還原

天然的N-糖在還原端能夠呈現(xiàn)α和β兩種構(gòu)型,通常需要將其還原以便消除這種異構(gòu)體[19]。還原方法如下:樣品用20 μL BAC溶液(10 g/L)溶解,置于65 ℃水浴中1.5 h。

1.3　LC-MS分析

衍生后的N-糖溶于50 μL 70%乙腈中,用LC-MS進行檢測。

使用HILIC進行分析時,流動相比例及儀器參數(shù)選用生物制藥企業(yè)普遍采用的配置,即流動相A為50 mmol/L pH 4.4甲酸銨溶液;流動相B為乙腈;柱溫恒定為40 ℃;流速保持0.4 mL/min。梯度洗脫程序設(shè)置如下:0 min, 70%B; 5 min, 65%B; 40 min, 50%B; 50 min, 50%B; 55 min, 70%B; 65 min, 70%B。

使用SiH-NPC進行分析時,流動相比例選用LC-MS常規(guī)配置,即流動相A為5%乙腈(含0.1% FA);流動相B為95%乙腈(含0.1% FA);柱溫恒定為35 ℃;流速保持0.4 mL/min。梯度洗脫程序設(shè)置如下:0 min, 70%B; 35 min, 60%B; 40 min, 50%B; 50 min, 50%B; 55 min, 70%B; 65 min, 70%B。

MS參數(shù):正離子模式;毛細管電壓為3.0 kV;錐孔電壓為35 V;離子源溫度為120 ℃;一級質(zhì)譜m/z區(qū)間為500～2 000,單次掃描時間為0.5秒;二級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴采集(DDA)模式,m/z區(qū)間為100～1 500,每個掃描周期內(nèi)掃描10次,共2.0秒。

2　結(jié)果與討論

2.1　分析路線

常見的單糖包括甘露糖(Man)、N-乙酰葡糖胺(GN)、半乳糖(G)、巖藻糖(F)、N-乙酰神經(jīng)氨酸(NANA)等,單糖殘基共價連接構(gòu)成N-糖。采用LC-MS技術(shù)分析單抗N-糖是近年來備受青睞的手段,尤其是在鑒定低豐度糖、糖同分異構(gòu)體等方面應(yīng)用廣泛[11,12]。還原胺化衍生結(jié)合HILIC法是生物制藥企業(yè)普遍采用的方法,因其存在一些缺陷,故本文嘗試選擇甲胺化衍生結(jié)合SiH-NPC法代替或補充經(jīng)典方法。SiH-NPC柱擁有部分HILIC柱的特性,也被認為是一種中性的HILIC柱。不過,SiH-NPC柱填料以獨特的Si-H鍵代替了傳統(tǒng)的Si-OH鍵,不僅有效增強了填料的使用壽命而且極大地減小了水分子與填料的相互作用,從而提供了與傳統(tǒng)HILIC不同的分離機制。

使用HILIC和SiH-NPC,通過LC-MS分析單抗N-糖的流程如圖1所示。還原胺化發(fā)生在糖的還原端,經(jīng)2-AA衍生后每個N-糖的相對分子質(zhì)量增加121 Da。甲胺化發(fā)生在非還原端的唾液酸殘基上,每個衍生位點導(dǎo)致N-糖的相對分子質(zhì)量增加13 Da(甲胺化并不會導(dǎo)致中性糖相對分子質(zhì)量發(fā)生變化),在N-糖被還原后相對分子質(zhì)量再增加2 Da。

圖 1 　通過HILIC和SiH-NPC分別表征單抗N-糖的流程圖Fig. 1 　Schematic characterization of the N-glycans of mAbs using HILIC (hydrophilic interaction liquid chromatography) and SiH-NPC (silica-hydride-based normal phase chromatography), respectively　

2.2　酸性糖痕量分析

本文采用HILIC分析鑒定了12種2-AA衍生的單抗N-糖(不包括同分異構(gòu)體);采用SiH-NPC分析N-糖時,不僅鑒定了此12種糖組分,還得到了其他的糖結(jié)構(gòu)。圖2顯示了兩種方法中G3F+NANA分別對應(yīng)的提取離子色譜圖(EIC)。如圖2a所示,在HILIC分析中并沒有檢測到G3F+NANA(m/z855.65,z=3);通過SiH-NPC分析則可以檢測到該糖結(jié)構(gòu)(m/z820.24,z=3)。經(jīng)甲胺化衍生后,唾液酸的羧基轉(zhuǎn)化成中性基團。中性化能夠增強酸性糖在正離子模式下的穩(wěn)定性和質(zhì)譜電離效率,從而提高其檢測靈敏度。因此,甲胺化相對于還原胺化更加有助于分析痕量的酸性糖,這也是G3F+NANA能夠被SiH-NPC分析鑒定的重要原因。

圖 2 　G3F+NANA的提取離子色譜圖和質(zhì)譜圖Fig. 2 　Extracted ion chromatograms (EICs) and mass spectra of G3F+NANA　a. HILIC for 2-AA (2-aminobenzoic acid) derivatized glycans; b. SiH-NPC for methylamined glycans; c. mass spectra for G3F+NANA.

2.3　糖同分異構(gòu)體分析

構(gòu)成寡聚糖的單糖殘基之間可以通過多種方式連接,這導(dǎo)致N-糖不僅是多分支(天線)結(jié)構(gòu),而且容易形成同分異構(gòu)體。如圖3a所示,HILIC法對N-糖異構(gòu)體具有一定的分離能力,尤其是因非還原端殘基的連接方式不同而形成的異構(gòu)體,例如G1F和G1F+NANA, HILIC法對半乳糖殘基不同的連接方式呈現(xiàn)較好的分離度。SiH-NPC法也能夠分離N-糖異構(gòu)體,如圖3b所示,主要包括G1F、G2F和G2F+NANA。但兩種分離方法得到的異構(gòu)體并不一樣。以G2F為例,圖4顯示了其EIC(m/z954.87和895.31,z=2),用HILIC法分析并沒有得到G2F的異構(gòu)體;用SiH-NPC法分析則得到3個異構(gòu)體?？紤]到G2F的異構(gòu)體主要由巖藻糖殘基形成,因此推測SiH-NPC法不同于HILIC法,主要識別巖藻糖殘基的連接位置,包括1種核心結(jié)構(gòu)(巖藻糖殘基連接于還原端的N-乙酰葡糖胺上)和2種末端結(jié)構(gòu)(巖藻糖殘基連接于非還原端的N-乙酰葡糖胺上)。但是巖藻糖殘基在電離時容易發(fā)生遷移,這導(dǎo)致同一張二級質(zhì)譜圖中既存在核心結(jié)構(gòu)的碎片離子也存在末端結(jié)構(gòu)的碎片離子,因此,僅通過質(zhì)譜圖很難確定巖藻糖殘基的位置[20],不能對上述推測進行合理的驗證?？傊?HILIC法和SiH-NPC法都可以分離N-糖的同分異構(gòu)體,但分離類型很可能不同,這也解釋了G2F+NANA各異構(gòu)體的相對豐度在兩種色譜分析方法中存在顯著差異的原因。

圖 3 　主要單抗N-糖的提取離子色譜圖Fig. 3 　EICs of the main N-glycans released from mAbs

圖 4 　G2F的提取離子色譜圖Fig. 4 　EICs of G2F#: the chromatographic peaks of extraction of ions.

2.4　糖組分保留時間分析

HILIC法和SiH-NPC法的另一個重要不同在于它們對N-糖的保留時間存在顯著差異。如圖3所示,在HILIC法中,樣品峰分布較為分散,分析時間較長;在SiH-NPC法中,樣品峰較為集中,分析時間較短。因此,后者更有利于單抗N-糖的快速分析,適合大量樣品的表征研究。此外,在SiH-NPC法中,樣品峰的保留時間(RT)與其單糖單位(GU)數(shù)量存在相關(guān)關(guān)系。當(dāng)設(shè)定Man、GN、G、F的單糖殘基單位為1、被甲胺化的NANA單糖殘基單位為2(NANA相對于其他單糖殘基較大,故設(shè)定為2)時,Man5、G0F、G1F、G2F、G1F+NANA、G2F+NANA的GU數(shù)量分別為7、8、9、10、11、12。此時,RT與GU之間呈線性相關(guān)關(guān)系(線性相關(guān)系數(shù)R=0.995)。已有研究[21]表明,通過反相色譜分離全甲基化的N-糖時,其保留時間和單糖殘基數(shù)目呈現(xiàn)線性關(guān)系,而本文進一步發(fā)現(xiàn),通過SiH-NPC法分析甲胺化的N-糖時也存在類似現(xiàn)象。不過造成此現(xiàn)象的原因并不相同。在反相色譜分析中,疏水相互作用是關(guān)鍵因素;在SiH-NPC法分析中,分子的大小和形狀可能是更加重要的影響因素。

圖 5 　甲胺化衍生結(jié)合SiH-NPC法分析單抗N-糖的重復(fù) 實驗中各糖組分同分異構(gòu)體的相對豐度Fig. 5 　Relative abundance of glycan isomers for repeated experiments in the analysis of N-glycans using methylamidation and SiH-NPC method

2.5　糖同分異構(gòu)體相對定量分析

通過SiH-NPC分析單抗N-糖時,主要獲得3種糖組分的同分異構(gòu)體,即G1F、G2F和G2F+NANA。為了探討此分析方案的穩(wěn)定性,本文對比了重復(fù)實驗中3種糖組分的各同分異構(gòu)體的相對豐度(見圖5)。G1F包含2個同分異構(gòu)體,其EIC的峰面積百分比分別為80.9%(RSD<2%)和19.1%(RSD<2%); G2F包含3個同分異構(gòu)體,其EIC的峰面積百分比分別為37.1%(RSD<2%)、59.0%(RSD<2%)和3.88%(RSD<8%); G2F+NANA包含2個同分異構(gòu)體,其EIC的峰面積百分比分別為47.6%(RSD<2%)和52.4%(RSD<2%)。這些結(jié)果表明,甲胺化結(jié)合SiH-NPC法穩(wěn)定性較高,可以用于單抗N-糖異構(gòu)體的相對定量研究。不過樣品峰總面積呈現(xiàn)差異性,這可能是由于酶切及富集純化過程中的變異性導(dǎo)致的。

3　結(jié)論

本文提出了甲胺化衍生結(jié)合SiH-NPC表征單抗N-糖基化的方法。該方法有效地克服了傳統(tǒng)方法的一些缺陷。SiH-NPC法提供了與HILIC法不同的分離機制,依據(jù)不同的實驗?zāi)康?可以選擇HILIC法和SiH-NPC法分別分析不同殘基引起的糖同分異構(gòu)體。此外,SiH-NPC法分離速度快且保留時間與糖鏈組成相關(guān)度高,因而可以用于快速分析以及評估糖鏈大小等。總之,甲胺化衍生結(jié)合SiH-NPC法能夠替代或補充還原胺化衍生結(jié)合HILIC法,在生物制藥行業(yè)中擁有重要的應(yīng)用前景。