劉俐伶 龐麗紅 植枝福 楊文梅

(1 廣西醫(yī)科大學，南寧市 530021；2 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學與遺傳中心，南寧市 530021；3 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，南寧市 530021)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis， EMS)是一種良性且常見的婦科疾病，其中卵巢型內(nèi)膜異位癥更是頻發(fā)于婦科臨床，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。為了加強對其病因病機等的基礎研究，科研人員一直不斷探索建立有利于研究該病的體內(nèi)外實驗模型。子宮內(nèi)膜異位癥體外模型包括組織模型和細胞模型。組織模型主要用于觀察早期異位組織侵襲、增殖和血管形成過程[1-3]。但體外培養(yǎng)的來源和條件不同，子宮內(nèi)膜組織培養(yǎng)時間不宜過長，最長的時間不應超過1周，否則，就會因改變組織的生理結(jié)構(gòu)而失去研究意義。細胞模型能很好地反映細胞在體內(nèi)的生物學特性，在一定程度上反映了細胞之間的相互作用，更接近于人體的真實環(huán)境，因此細胞模型仍是目前研究EMS發(fā)病機制的重要方式。由于一直缺乏穩(wěn)定可靠的細胞系，原代細胞培養(yǎng)是EMS體外研究的一種重要方法。但是原代細胞培養(yǎng)技術要求高，成功率低，最早報告的子宮內(nèi)膜異位間質(zhì)細胞的培養(yǎng)成功率僅為56%[4]，近幾年相關學者報道的成功率也僅為60%～70%。本研究首次對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞原代培養(yǎng)方法進行探索改良，取得了明顯的效果?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本采集 選取2016年3月至12月在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科住院的15例卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥患者，經(jīng)組織學明確入選，獲取子宮內(nèi)膜異位囊腫即巧克力囊腫內(nèi)壁；另選15例經(jīng)宮腹腔鏡檢查證實為輸卵管性不孕的患者，獲取子宮內(nèi)膜組織。卵巢型內(nèi)異癥患者中按評分全部為Ⅲ/Ⅳ期，年齡21～35(29.1±0.2)歲，不孕患者年齡26～35(28.2±0.7)歲。兩組均取自增生期內(nèi)膜，取樣前3個月無激素治療史。無菌條件下操作獲得組織標本，立即置于4℃預冷的含有雙抗(青霉素、鏈霉素各100 IU/mL)的無菌1640培養(yǎng)液中，1 h內(nèi)送至實驗室，在生物安全柜中進行細胞分離(操作前生物安全柜需紫外線消毒30 min，開啟風機15 min，并用75%酒精擦拭超凈臺)。

1.1.2 主要儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱(ThermoFisher)；BCM-1000A型凈化工作臺(AIRTECH)；微量可調(diào)移液器(法國Glison公司)；OLYMPUS倒置相差顯微鏡(CKX53)；湘儀Td5a-ws離心機；杭州米歐儀器渦旋振蕩器(MZX-28+)；SH2-88型37℃恒溫水浴搖床(上海安亭科技儀器廠)；ThermoFisher酶標儀(MULTISKAN FC)。

1.1.3 主要試劑 無菌PBS溶液(美國Hyclone公司)；100 IU/mL青霉素、鏈霉素(雙抗)溶液(美國Sigma公司)；胎牛血清(美國Gbico公司)；RPMI-1640培養(yǎng)液(美國Gbico公司)；25%不含EDTA的胰蛋白酶消化液(美國Gbico公司)；鼠抗人波形蛋白單克隆抗體(vimentin)、鼠抗人角蛋白單克隆抗體(北京中杉公司)；CCK-8試劑盒(C0038 Cell Counting Kit-8碧云天公司)；完全培養(yǎng)基(血清濃度為20%)：含雙抗1640溶液 ∶胎牛血清=4 ∶1；鼠抗人波形蛋白單克隆抗體(vimentin)；鼠抗人角蛋白單克隆抗體。

1.2 實驗方法 將組織標本在無菌生物安全柜中用含有雙抗的PBS液或無菌生理鹽水清洗數(shù)次以去除血凝塊，并盡量剪除結(jié)締組織。在無菌培養(yǎng)皿中用組織剪和眼科剪將內(nèi)膜組織剪成體積約1.0 mm3的碎顆粒，再用PBS溶液清洗組織塊至清洗液清亮。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清；然后將剪碎的內(nèi)膜組織用無菌鑷轉(zhuǎn)移至離心管中；加入PBS，1 000 r/min離心5 min，去上清，再次去除血凝塊等雜質(zhì)。加入0.25%不含EDTA的胰酶(約為組織體積的3倍)，在37℃水浴箱中消化，到時間后用完全培養(yǎng)液終止消化。消化終止后入離心機1 000 r/min離心5 min，靜置后，吸去上清，加1640培養(yǎng)基用吸管反復吹打組織塊，使細胞分離，靜置，使未分散的組織塊下沉。用200目篩網(wǎng)研磨過濾后，過濾時須使濾網(wǎng)保持一定的張力，并用無菌鑷輕輕撥動過濾組織，使其充分過濾，無菌離心管收集濾液(即為間質(zhì)細胞)。取濾液加血清濃度20%含雙抗完全培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻后將細胞接種至六孔板中，并加上述培養(yǎng)液至2 mL細胞生長液置入六孔板中，置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后倒掉培養(yǎng)基，去除紅細胞等非貼壁懸浮物，加入2 mL新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以后每2～3 d換液，倒置顯微鏡下觀察間質(zhì)細胞形態(tài)。

1.3 觀察指標

1.3.1 細胞的鑒定 波形蛋白已被證明存在于間質(zhì)細胞，所以波形蛋白可以作為一抗，采用細胞免疫組化法(SP法)對間質(zhì)細胞進行鑒定。此染色過程中，用鼠抗人角蛋白單克隆抗體替代第一抗體做陰性對照。

1.3.2 光學顯微鏡觀察 將無菌蓋玻片放入六孔培養(yǎng)板中，消化分離后的間質(zhì)細胞接種于六孔培養(yǎng)板蓋玻片上，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從培養(yǎng)皿中取出間質(zhì)細胞生長良好的載玻片，用 PBS液洗去原培養(yǎng)液，用95%乙醇固定，常規(guī)HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.3.3 CCK8檢測細胞增殖情況 細胞接種96孔板，細胞孵育0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后分別加入CCK-8顯色液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育60 min。取出96孔板于酶標儀讀取各孔OD450吸光值，繪制細胞增殖曲線。

1.3.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 取105個細胞，1 200 r/min離心5 min，去上清液。每管加入50 μL 1×Binding Buffer，重懸，按以下分組加入染料：a.陰性對照：不加任何染料；b.單陽對照：加入5 μL FITC Annexin V；c.單陽對照：加入5 μL PI；d.樣本管：加入5 μL FITC Annexin V和5 μL的PI。將溶液輕輕震蕩后，避光在室溫下(25℃)孵育15 min，分別加入400 μL 1×Annexin V Binding Buffer，在1 h內(nèi)上機。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料比較用獨立樣本t檢驗；重復測量資料比較采用重復測量方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 原代細胞分離培養(yǎng)情況 分離培養(yǎng)的15份正常子宮內(nèi)膜標本，成功14份，分離培養(yǎng)成功率為 93.33%；分離培養(yǎng)的15份EMS異位內(nèi)膜標本，成功13份，分離培養(yǎng)成功率為86.67%。

2.2 細胞類型鑒定結(jié)果 間質(zhì)細胞波形蛋白染色呈陽性反應，細胞純度達85%，經(jīng)1次傳代后，純度可達90%以上。見圖1。

圖1 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞免疫組化鑒定(A.正常內(nèi)膜間質(zhì)細胞，B.異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞，20×)

2.3 兩種間質(zhì)細胞生長特點及形態(tài)差異

2.3.1 生長特點差異 正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞貼壁率高，均勻穩(wěn)定生長，1周左右達到對數(shù)生長期。異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞開始貼壁率低，生長緩慢，呈集落式生長，形成集落后生長迅速，呈腫瘤樣旋渦狀生長，常有中心壞死灶，一般需4周達到對數(shù)生長期。

2.3.2 形態(tài)差異 顯微鏡顯示正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞分散生長，呈紡錘狀，胞核不易看出，細胞之間無明顯界限，大多平行排列。HE染色顯示細胞形態(tài)均一。異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞像腫瘤樣集落抱團生長，胞核大，細胞分裂象多，細胞之間貼近密集生長，生長旺盛時常有局部缺血壞死。HE染色顯色細胞形態(tài)大小不一，異質(zhì)性明顯。異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞比正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的細胞形態(tài)明顯增大。見圖2、圖3。

2.4 傳代情況 兩組間質(zhì)細胞均可傳代8～10代，但是正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞5代后細胞生長明顯減慢，異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞7代后細胞生長開始減慢，細胞形態(tài)改變。

圖2 正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞形態(tài)(HE染色，A：10×；B：40×)

圖3 異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞形態(tài)(HE染色，A：10×；B：40×)

2.5 細胞增殖率比較 子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞(ESC)比正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞(NSC)增殖旺盛。增殖48 h、72 h時ESC的細胞相對增殖率明顯高于NSC，差異均有統(tǒng)計學意義(P48h<0.001；P72h<0.001)。見圖4。

圖4 細胞增殖率比較

2.6 細胞凋亡情況比較 24 h、48 h、96 h的NSC凋亡率明顯高于ESC，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。72 h時，NSC、ESC凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 NSC、ESC凋亡情況

3 討 論

子宮內(nèi)膜異位癥中異位的子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì))除了具有生長功能，還具有類似惡性腫瘤的增生、侵襲、黏附等惡性生物學行為[5]，有一定的惡變率，但是其病因病機等基礎研究一直沒有明確的結(jié)論。這除了因為該疾病的異質(zhì)性外，缺乏理想的實驗模型也是一個重要的因素。目前該疾病的體內(nèi)研究模型中最理想的是非人靈長類動物模型，但由于動物來源稀缺而且價格昂貴，不利于大樣本研究。所以大多選用嚙齒類動物和新西蘭兔等，這些動物無月經(jīng)周期，不會自發(fā)形成子宮內(nèi)膜異位癥，且具有一定的局限性，不能很好地模擬人體的真實情況。而體外模型因為能從多角度反映疾病的發(fā)展變化特征，從而成為研究疾病的重要手段。

一直以來研究者都在積極建立細胞系，但是效果不佳。從最早研究的由原代內(nèi)膜間質(zhì)細胞經(jīng)猴空泡病毒40、SV40(simian virus40)轉(zhuǎn)染而類永生化的內(nèi)異間質(zhì)細胞系被發(fā)現(xiàn)有高化例的畸形現(xiàn)象[6]，再到后來文獻報道應用端粒酶技術處理原代細胞而培養(yǎng)的異位內(nèi)膜上皮細胞系Z11及異位內(nèi)膜的間質(zhì)細胞22B[7]；另外也有HESC等細胞系[8]由實驗室續(xù)轉(zhuǎn)染處理后永生化，但有相當一部分被其他細胞系污染(如HELA)，研究至今仍有使用代數(shù)較老、細胞狀態(tài)不穩(wěn)定等問題。因此針對EMS發(fā)病基礎的生物學研究，一直缺乏穩(wěn)定可靠的細胞系，EMS體外細胞實驗仍主要以原代細胞培養(yǎng)為主，但是原代培養(yǎng)要求技術高，成功率低，為此我們在查閱相關文獻的基礎上，結(jié)合細胞的生長特點及我們的具體實踐，摸索及改良了子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)方法：①組織的取材需要注意避免污染，異位內(nèi)膜組織要選取病變較新鮮同時有一定組織厚度的部分，該部分提示病變活躍，在進展期容易獲得細胞。②個性化的組織消化時間非常重要。對于正常子宮內(nèi)膜組織消化時間為30～60 min即可；針對不同厚度的異位內(nèi)膜組織，消化時間控制在120～160 min，胰酶量為組織量的2～3倍較為合適，緩慢消化后得到的活性細胞較多。③針對異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞不易貼壁的特點，選用不含EDTA的胰酶可減少對細胞的損傷，增加細胞貼壁率。④針對異位間質(zhì)細胞具有類腫瘤的生長特性，我們選用了腫瘤細胞培養(yǎng)常用的1640培養(yǎng)基取代常規(guī)文獻報道的培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)液的血清濃度由10%提高到20%。⑤我們采用6孔板培養(yǎng)，比培養(yǎng)瓶培養(yǎng)容易在早期形成細胞集落，增加培養(yǎng)成功率。待孔板底基本生長滿后移到培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，此時細胞已進入生長旺盛期，培養(yǎng)更容易成功。通過多環(huán)節(jié)的改良，我們發(fā)現(xiàn)原代細胞培養(yǎng)成功率得到明顯的提高，以上改良的實驗方法國內(nèi)外尚未見相關報道。

現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，EMS患者在位及異位內(nèi)膜存在細胞的異常增殖、異常程序性凋亡和降低的凋亡易感性[9-11]，這些都促進了該疾病的存在及發(fā)展，多種分子生物學改變存在于內(nèi)異癥，包括已被報道的細胞存活信號的異常激活[12-14]，但是具體的分子機制仍有待進一步明確研究。由此可見對EMS細胞中的相關機制研究，是研究發(fā)病機制的重要方式。為了證明我們建立的體外細胞模型仍具有疾病的特征，能成為疾病研究的良好模型，我們對于體外培養(yǎng)的細胞增殖及凋亡情況進行了相關的研究。結(jié)果表明：與正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞相比，異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞增殖明顯增強。在不同的時間點，正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞與異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞的凋亡比較結(jié)果并不一致，其中72 h兩者凋亡比較無差異，24 h、48 h、96 h三個時間點與正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞相比，異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞明顯凋亡減少，總體趨勢表明異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞的明顯凋亡減少。由此可見，我們建立的體外細胞模型中細胞的生長特性與子宮內(nèi)膜異位癥的疾病特點是一致的，細胞生物學行為表現(xiàn)為增殖增強、凋亡減少的特性，可作為疾病機制研究的理想細胞模型。

子宮內(nèi)膜異位癥是一種激素依賴性疾病，為了排除激素水平對細胞的影響，我們均選用了增殖期的內(nèi)膜組織。處于分泌期的內(nèi)膜組織是否具有不同的特性，尚有待我們進一步的研究。

參 考 文 獻

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