林　輝，詹森然，李佳歡，金文松，孫淑靜，胡開輝

(福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

食用菌菌種質(zhì)量直接關(guān)系到出菇產(chǎn)量的高低和栽培的成敗[1]，它是食用菌生產(chǎn)的基礎(chǔ)。

目前，食用菌栽培主要使用固體菌種，農(nóng)業(yè)部門對菌種生產(chǎn)的監(jiān)督管理主要停留在母種和原種的生產(chǎn)許可上，栽培種基本上由農(nóng)戶自行聯(lián)合擴繁[2]。由于條件設(shè)施、認(rèn)識水平和管理水平不足，栽培種擴繁不規(guī)范，容易造成擴繁過程菌種隱性污染。另外，菌種的培養(yǎng)時間及外界環(huán)境把控不精準(zhǔn)，菌種質(zhì)量難以保障，并且依次繼代培養(yǎng)制備栽培種，存在菌種退化現(xiàn)象。隨著菌種制備設(shè)施升級與管理水平的提高，大部分問題都已經(jīng)得到有效的解決，但是菌種繼代培養(yǎng)造成的退化現(xiàn)象仍然是食用菌生產(chǎn)的突出問題。菌種的退化造成菌落生長速度不一致，菌絲體吃料速度減慢或不吃料，氣生菌絲稀疏或出現(xiàn)扇變菌落，出菇(耳)期延長、菇潮不明顯，畸形菇增多，品質(zhì)、產(chǎn)量下降，抗性降低等[3]。

斑玉蕈(Hypsizygusmarmoreus)是我國工廠化生產(chǎn)的主要食用菌菌類品種之一，生產(chǎn)周期長，從接種到采摘需要120 d。使用退化的斑玉蕈菌種種植一段時間后，會出現(xiàn)大規(guī)模減產(chǎn)，增加了斑玉蕈工廠化種植的風(fēng)險。因此，建立一套斑玉蕈菌種質(zhì)量控制體系，明確菌種使用代數(shù)成為目前斑玉蕈工廠化亟需解決的問題。已有研究表明，通過生理生化角度判斷菌種質(zhì)量是有效的[4]。賀元川等[5]通過香灰菌的傳代培養(yǎng)進(jìn)行銀耳種植，發(fā)現(xiàn)隨著傳代次數(shù)的增加，漆酶、纖維素酶活力逐漸降低，銀耳產(chǎn)量下降。本試驗通過斑玉蕈菌種連續(xù)繼代培養(yǎng)，分析測定不同代數(shù)斑玉蕈菌種關(guān)鍵酶活性、生理特性的變化及出菇情況，探討斑玉蕈連續(xù)傳代過程中的菌種退化情況，以明確斑玉蕈菌種用種代數(shù)，為斑玉蕈工廠化栽培提供基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1　試驗材料

1.1.1供試菌株斑玉蕈通過繼代培養(yǎng)獲得的10代菌種保存于福建農(nóng)林大學(xué)(古田)菌業(yè)研究院。

不同代數(shù)菌種制備：取斑玉蕈試管種(原種)，將其直接接種在裝有固體栽培料40 g的大試管中，培養(yǎng)30 d。將走滿大試管的斑玉蕈進(jìn)行保種，即為第1代菌種，同時將第1代菌種繼續(xù)轉(zhuǎn)接至裝有40 g栽培料的大試管種，培養(yǎng)30 d，進(jìn)行保種，即為第2代菌種，同時將第2代菌種繼續(xù)轉(zhuǎn)接至裝有40 g栽培料的大試管中，培養(yǎng)30 d。以此類推，直至第10代菌種。獲得原種和10代不同傳代次數(shù)的菌種。

1.1.2培養(yǎng)基(1)固體PDA培養(yǎng)基(1 L)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、酵母粉3 g、MgSO7·7H2O 1.5 g、KH2PO41.5 g、VB 10.1 g。121 ℃滅菌30 min，冷卻后備用。

1.1.3栽培料配方棉籽殼53%、木屑17%、石灰2%、麩皮23%、玉米粉5%、含水量65%。121℃滅菌120 min，冷卻后備用。

1.2　測定項目及方法

1.2.1不同代數(shù)菌種菌絲生長質(zhì)含量的測定將不同代數(shù)斑玉蕈接種至PDA平板，每代接3個平板，放置在24 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d，待平板長滿后用打孔(孔徑1 cm)的方式轉(zhuǎn)接到其他平板上，每代菌種接10個平板，菌絲萌發(fā)后每天測量其生長速度，直到平板長滿。

1.2.2不同代數(shù)菌種基質(zhì)降解酶活性、還原糖與可溶性蛋白質(zhì)含量的測定粗酶液提?。簩⒉煌鷶?shù)斑玉蕈接種在裝有固體栽培料40 g的大試管中，培養(yǎng)30 d，菌絲走滿栽培料。將試管栽培料取出揉碎、混勻，精確稱取10 g，加入50 mL水，26 ℃，120 r/min搖床2 h。8 000 r/min，4 ℃離心15 min。上清液即為粗酶液，測定酶活力、可溶性蛋白和還原糖含量。

酶活力的測定：淀粉酶測定采用碘試液比色法[6]；漆酶測定采用ABTS法[7]；可溶性蛋白質(zhì)測定采用考馬斯亮藍(lán)法[8]；還原糖測定采用DNS法[9]；纖維素酶測定采用CMC-Na法[10]；木聚糖酶測定采用木聚糖降解法[11]；中性蛋白酶測定參照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23527—2009進(jìn)行[12]。

1.3　不同代數(shù)菌種出菇試驗

取活化后的不同代數(shù)的斑玉蕈菌種接入裝有200 g栽培料的栽培瓶中，各接50瓶，接完種的栽培瓶置于25 ℃養(yǎng)菌房內(nèi)養(yǎng)菌，培養(yǎng)90 d。將所有的栽培瓶轉(zhuǎn)移至寧德市古田縣福泉鑫生物科技有限公司出菇房進(jìn)行統(tǒng)一出菇。待出菇完畢后，各代隨機抽取10瓶栽培瓶分別測定菇質(zhì)量與出菇蕾數(shù)、菇蓋直徑、菇的長度等農(nóng)藝性狀。

1.4　數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用Excel軟件進(jìn)行處理。

2　結(jié)果與分析

2.1　繼代培養(yǎng)對斑玉蕈菌種菌絲生長速度的影響

菌絲的生長速度是目前判斷菌種菌絲活力最直觀、最常見、最快速的方法。由表1可以看出，不同代數(shù)斑玉蕈菌種在固體PDA培養(yǎng)基上菌絲生長速度差異較大，0～4代速度較快，4代以后的菌種菌絲生長速度則明顯下降，第10代菌種生長速度僅為1.36 mm/d，相對親本菌株生長速度降低27%。

表1　不同代數(shù)斑玉蕈菌種的菌絲生長速度

注：同列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

2.2　繼代培養(yǎng)對斑玉蕈菌種還原糖與可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

斑玉蕈不能直接利用栽培料中木質(zhì)纖維素等多糖類物質(zhì)，需要通過分泌相關(guān)的胞外酶將其降解為可直接吸收的還原糖，而這些胞外基質(zhì)降解酶是可溶性蛋白質(zhì)的主要組成部分。因此還原糖、可溶性蛋白質(zhì)的含量可以反映出斑玉蕈分解利用基質(zhì)的強度及菌絲營養(yǎng)供給水平。由表2可看出，0～4代斑玉蕈的還原糖含量高(>5 mg/mL)，4代以后還原糖含量隨著菌種傳代次數(shù)的增加逐漸下降；4～10代菌種的胞外可溶性蛋白質(zhì)含量略低于0～3代。說明0～4代斑玉蕈的菌絲代謝較為旺盛，碳水化合物轉(zhuǎn)化快，隨著菌種傳代次數(shù)的繼續(xù)增加，菌絲營養(yǎng)供給水平降低，代謝能力有所下降。

表2　不同代數(shù)斑玉蕈菌種生長過程中還原糖與可溶性蛋白質(zhì)含量的變化

2.3　繼代培養(yǎng)對斑玉蕈菌種關(guān)鍵酶活力的影響

栽培料主要含有蛋白類與纖維素、木質(zhì)素、淀粉等多糖類營養(yǎng)物質(zhì)，需要蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、漆酶、淀粉酶等基質(zhì)降解酶分解為單糖，供應(yīng)菌絲生長代謝的需要。因此菌種胞外基質(zhì)降解酶的活性可以直接反映出對基質(zhì)降解利用情況與菌絲生長代謝情況，是菌種質(zhì)量判斷的重要指標(biāo)。

由表3可以看出， 0～10代斑玉蕈在培養(yǎng)過程中的中性蛋白酶、木聚糖酶和漆酶活性隨著菌種傳代次數(shù)的增加呈下降趨勢，其中0～4代斑玉蕈的中性蛋白酶和漆酶活性較高、變化較小， 5～6代中性蛋白酶和漆酶活性略有降低，7代以后蛋白酶和漆酶活性顯著下降，至第10代蛋白酶和漆酶酶活力分別下降38%、25%。0～6代斑玉蕈菌種的木聚糖酶活性隨著傳代次數(shù)的增加顯著降低，第6代以后木聚糖酶活性基本不變，保持在34.6 U/L左右。0～10代斑玉蕈菌種的淀粉酶活性均在22.03～23.14 U/mL，酶活力基本保持穩(wěn)定。而0～10代斑玉蕈菌種的羧甲基纖維素酶活性隨著菌種傳代次數(shù)的增加逐漸提高，第10代的纖維素酶活力相對原始菌種提高了3.01 U/mL，這可能是由于真菌繼代過程中在其他基質(zhì)降解酶活力降低、代謝紊亂情況下的一種生物體的自我應(yīng)急保護(hù)機制。

表3　不同代數(shù)斑玉蕈菌種生長過程中關(guān)鍵酶活力的變化

續(xù)表3　不同代數(shù)斑玉蕈菌種生長過程中關(guān)鍵酶活力的變化

2.4　繼代培養(yǎng)對斑玉蕈菌種出菇產(chǎn)量和農(nóng)藝性狀的影響

從圖1可以看出，從0～4代斑玉蕈的菇整體較為整齊，一致性好，菇樅碩大，菇體較為粗壯，菇柄較粗，菇蓋較厚較大；5～6代斑玉蕈的菇較為整齊，但菇體比前幾代較細(xì)、矮；7～10代則表現(xiàn)出菇體較為矮小，菇柄較細(xì)，菇蓋直徑較小，大小不一，且菇樅稀疏。

圖1　不同代數(shù)斑玉蕈菌種的出菇情況

由圖2可知，0～5代斑玉蕈的子實體鮮質(zhì)量較高，均大于55 g；而第6～10代斑玉蕈的子實體鮮質(zhì)量較低，均小于51 g。說明斑玉蕈經(jīng)過連續(xù)10次的傳代后，在生產(chǎn)上，0～5代的產(chǎn)量保持較高水平，而6代后產(chǎn)量明顯下降，特別是8～10代出現(xiàn)嚴(yán)重減產(chǎn)，第10代產(chǎn)量僅為28.7 g/瓶。

圖2　不同代數(shù)斑玉蕈菌種的子實體鮮質(zhì)量

由表4可以看出，0～5代斑玉蕈的出蕾數(shù)與菇數(shù)多，5代后菇數(shù)與出菇數(shù)隨著傳代次數(shù)增加逐漸減少。從菇蓋的直徑看，0～4代菇蓋直徑較5～10代大，成品菇(菌柄長度≥8 cm)的變化規(guī)律與菌蓋直徑變化情況一致。9～10代的斑玉蕈菌柄長度顯著降低。綜上，說明在不同代數(shù)斑玉蕈菌種的出菇質(zhì)量中，0～4代斑玉蕈菌種的出菇質(zhì)量優(yōu)于5～10代斑玉蕈菌種，尤其是7代后的斑玉蕈菌種，出菇數(shù)量少，菇體發(fā)育差。

表4　不同代數(shù)斑玉蕈菌種的子實體農(nóng)藝性狀

3　結(jié)論與討論

目前我國菌種市場比較混亂，優(yōu)質(zhì)菌種引進(jìn)后連續(xù)轉(zhuǎn)管，工廠與菌種商不了解多次繼代培養(yǎng)后菌種退化對生產(chǎn)造成的嚴(yán)重后果，通過對斑玉蕈繼代培養(yǎng)過程中生理生化與農(nóng)藝性狀指標(biāo)的測定，探索斑玉蕈連續(xù)傳代過程中的退化情況，可以為工廠用種規(guī)范提供借鑒。

從不同代數(shù)斑玉蕈生理生化特性測定結(jié)果可以看出，斑玉蕈菌種在連續(xù)傳代過程中，傳代至第4代后，菌絲生長速度逐漸降低，這與李曉等[13]的黑木耳母種繼代培養(yǎng)研究結(jié)果相同；還原糖含量隨著傳代次數(shù)的增加逐漸下降，4～10代菌種的胞外可溶性蛋白質(zhì)含量略低于0～3代，原料降解速度與營養(yǎng)供給水平下降，這與劉貴巧等[14]、王東明等[15]在平菇與香菇的研究結(jié)果一致。在基質(zhì)降解酶的方面，0～4代斑玉蕈關(guān)鍵酶活力基本保持不變，4代以后中性蛋白酶、漆酶、木聚糖酶活力開始大幅度下降，對基質(zhì)培養(yǎng)料的降解能力下降。馬丹丹等[16]、李莎等[17]利用食用菌分泌漆酶作為快速判斷金針菇、白靈菇菌種退化程度的參數(shù)；淀粉酶在斑玉蕈傳代過程中酶活力基本不變；而纖維素酶活力在斑玉蕈傳代至第6代以后，隨著傳代次數(shù)的增加逐漸提高，這一現(xiàn)象與中性蛋白酶、漆酶、木聚糖酶活力表現(xiàn)相反，這可能是由于斑玉蕈在生長發(fā)育過程中代謝紊亂情況下的一種自我應(yīng)激調(diào)節(jié)機制。

出菇表現(xiàn)上，0～4代出菇產(chǎn)量較高，而第4代以后出菇產(chǎn)量明顯降低；其中，0～4代蕾數(shù)、菇數(shù)、成品菇數(shù)量多，菇體在菌柄長度和菌蓋直徑上較大，4代后菌種蕾數(shù)、菇數(shù)、成品菇數(shù)量減少，菇體菌柄長度與菌蓋直徑減小。

綜上所述，斑玉蕈在菌種使用上4代以內(nèi)為宜，4代后生產(chǎn)性能降低，對原料的降解能力與營養(yǎng)供給水平顯著下降，減產(chǎn)明顯。