高 飛，張 明，朱紹玲，熊 洋

（1遵義醫(yī)學(xué)院物理教研室，貴州遵義562503；2遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，貴州遵義562500；3楚雄師范學(xué)院光譜技術(shù)應(yīng)用研究所，云南 楚雄 675000）

0 引言

近些年來，肺癌這種常見惡性腫瘤的死亡率以及發(fā)病率均迅速攀升，極大地威脅著各國人民的生命健康［1］。 數(shù)據(jù)［2］顯示，我國每年死于肺癌的人數(shù)高達(dá)60余萬，這種疾病的累計危險性已經(jīng)迅速攀升至首位。一直以來，醫(yī)學(xué)界均尚未探索出比較高效且完善的肺癌診斷治療方案，因此很難及時發(fā)現(xiàn)并診斷肺癌。這種情況直接導(dǎo)致了許多肺癌患者被誤診或病情延誤，往往在就診時已經(jīng)發(fā)展至晚期。就現(xiàn)階段而言，支氣管鏡檢查、放射性核素檢查、細(xì)胞學(xué)檢查、X射線檢查、剖胸探查術(shù)、ECT檢查、縱膈鏡檢查等為臨床常見的肺癌診斷檢查方法［3－4］，不過從客觀上來講，上述方法都不是完善的，均存在著一定的缺陷與不足，如費用高昂，操作復(fù)雜度較高，靈敏度較低，會對患者造成創(chuàng)傷等。與此同時，應(yīng)用這些方法診斷肺癌還存在著檢測盲區(qū)、假陰性等問題［5］。在這一背景下，想要有效提升肺癌患者的生存率，當(dāng)務(wù)之急在于探索出一套安全、簡便的早期肺癌檢測方法。

利用靈敏度高、簡單快捷、生物兼容性好等優(yōu)點的近紅外表面增強(qiáng)拉曼散射（near infrared surface?en?hanced Raman scattering，NIR?SERS）光譜技術(shù)可以直觀地獲取分子含量以及轉(zhuǎn)動、振動信息［6］。目前，這種技術(shù)在臨床領(lǐng)域已經(jīng)有了基本的應(yīng)用。醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域也逐步引入了此項技術(shù)。在本研究中，將NIR?SERS基底定為二維納米銀膜，對肺癌患者以及健康人進(jìn)行NIR?SERS光譜檢測分析，主要通過785 nm近紅外激光波長來檢測并分析研究氧合血紅蛋白，有利于提高肺癌SERS光譜技術(shù)診斷效率以及可行性。從一定程度上來講，NIR?SERS技術(shù)具備應(yīng)用于肺癌臨床診斷領(lǐng)域的潛力與價值。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 血液樣品：2015年5月至7月在遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院采集血液，從健康人和肺癌患者胳膊抽靜脈血液樣本各25例，樣品規(guī)格均為3 mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取氧合血紅蛋白 第一步，血液樣本編號。完成編號后分別提取每個樣本各2 mL，37℃室溫放置使其自然凝結(jié)，放置時間為1 h，血樣凝結(jié)后利用小型臺式離心機(jī)進(jìn)行5000 r／min，5 min的離心處理，待樣品分層后將下層血紅細(xì)胞提取出并分裝至新的離心管中，提取量為200 μL。向提取的紅細(xì)胞中加入九倍體積的去離子水，緩慢混合后再次進(jìn)行5000 r／min，

5min的離心處理，溶液分層后的中間層便是氧合血紅蛋白。抽取500 μL中間層溶液置于4°C保存，用于后續(xù)檢測處理。

1.2.2 氧合血紅蛋白 NIR?SERS光譜測定 測定方案參照劉仁明等制備二維納米銀膜的方法［7］，在納米銀膜基底上均勻涂覆制備好的氧合血紅蛋白樣品，涂覆量為60 μL，使其均勻覆蓋在基底上并形成直徑約1 cm的液體薄膜。待其自然干燥后利用美國海洋光學(xué)公司生產(chǎn)的便攜式拉曼光譜儀（R?2500TM）進(jìn)行檢測。NIR?SERS光譜的測定選取了785 nm激光波長，采用垂直照射的方法，參數(shù)：激光功率密度J＝103W·cm－2，每次掃描16 s，掃描次數(shù)為2次。為了降低實驗誤差，各樣品分別測試三條譜線并取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)分析與處理采用的工具包括2007excel、Origin 8.0、SPSS19.0、Raman Spectrum 等。

2 結(jié)果

2.1 氧合血紅蛋白NIR-SERS光譜 將NIR?SERS基底定為二維納米銀膜，對肺癌患者以及健康人進(jìn)行NIR?SERS光譜檢測分析，每組研究對象的樣本數(shù)量均為25名，圖1A為25名健康人氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜，圖1B為25名肺癌患者氧合血紅蛋白NIR?SERS 光譜。

圖1 氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜

將25名健康人（A）和25名肺癌患者（B）氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜求出平直曲線，并將譜線平均值向上／下平移處理，進(jìn)而獲取到直觀的對比結(jié)果。圖2為25名健康人（A）和25名肺癌患者（B）氧合血紅蛋白平均NIR?SERS光譜比對，由圖2可知，就氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜分析結(jié)果而言，兩組樣品具備明顯差異。相比于健康人，肺癌患者的氧合血紅蛋白 NIR?SERS光譜強(qiáng)度相對較小。 在 473、662、723、816、1126、1208、1336、1425、1583 cm－1均出現(xiàn)了兩組研究樣本氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜共有的譜峰；圖中健康人和肺癌患者光譜譜峰強(qiáng)度有明顯區(qū)別，相比于肺癌患者，在 662、723、816 cm－1等位置處健康人氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜譜峰強(qiáng)度相對較大；473、816、1583 cm－1處健康人的氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜出現(xiàn)的拉曼譜峰較肺癌患者更為明顯。另外，在1583 cm－1處，健康人氧合血紅蛋白平均NIR?SERS 光譜出現(xiàn)藍(lán)移現(xiàn)象，藍(lán)移至 1579 cm－1，肺癌患者在1208、1425 cm－1處譜峰出現(xiàn)紅移現(xiàn)象，移動至 1212、1432 cm－1。

圖2 25名健康人（a）和25名肺癌患者（b）氧合血紅蛋白平均NIR?SERS光譜比對

2.2 t檢驗結(jié)果分析 對25名健康人和25名肺癌患者氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜扣除熒光背景，由于光譜中信息主要來自譜峰的相對強(qiáng)度和形狀，故將在400～1800 cm－1范圍內(nèi)的譜峰進(jìn)行面積歸一化，面積歸一化可以消除由于實驗條件的微小差異對實驗結(jié)果的影響。本實驗采用的面積歸一法就是指把氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜的譜峰面積逐個算出來（采用 Origin作圖軟件計算譜峰面積），如 S1、S2、S3.....Sn，然后把每個譜峰的面積相加得 S 總，再用每個譜峰的面積 S1、S2、S3.....Sn 除以總面積 S 總得到每個譜峰所占的面積比 A1、A2、A3...An，即An＝Sn／S總。表1是 25名健康人和 25名肺癌患者在 473、662、723、816、1126、1208、1336、1425、1583 cm－19處譜峰面積的顯著性分析。

通過表1顯著性分析可以看出肺癌患者相對正常人在473 cm－1處譜峰面積 A1和1583 cm－1處譜峰面積A9有所減小，達(dá)到顯著水平。肺癌患者相對正常人在816 cm－1處譜峰面積A4明顯減小，達(dá)到極顯著水平。對25名健康人和25名肺癌患者在473、662、723、816、1126、1208、1336、1425、1583 cm－19 處譜峰面積的顯著性分析得出的結(jié)果與上述NIR?SERS光譜分析基本吻合，從而更加驗證了上述分析結(jié)論。

表1 25 例健康人和 25 例肺癌患者在 473、662、723、816、1126、1208、1336、1425、1583 cm－19 處譜峰面積的顯著性分析

3 討論

從表1氧合血紅蛋白拉曼譜峰的初步歸屬［9－12］中能夠清晰直觀地了解生物分子變化所導(dǎo)致的肺癌患者血紅蛋白NIR?SERS光譜變化的具體機(jī)理，氧合血紅蛋白分子乙烯基團(tuán)（CaCm）的對稱和反對稱伸縮振動分別是引發(fā)處于1425、1583 cm－1附近的拉曼譜峰的根本原因；吡咯環(huán)間CmH基團(tuán)的變形振動是引發(fā)處于1208 cm－1附近的拉曼譜峰的根本原因；吡咯半環(huán)的反對稱以及對稱伸縮振動分別是引發(fā)處于1126、1336 cm－1附近的拉曼譜峰的根本原因。

由圖2可知，相比于健康人而言，在1583、816、473 cm－1處肺癌患者的氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜譜峰強(qiáng)度較小，從表2氧合血紅蛋白拉曼譜峰的初步歸屬得知上述三個譜峰的產(chǎn)生原因分別為氧合血紅蛋白分子乙烯基團(tuán)（CaCm）的反對稱和對稱伸縮振動、氧合血紅蛋白吡咯環(huán)的對稱和反對稱變形振動、氧合血紅蛋白水合高鐵血紅蛋白吡咯環(huán)折疊振動，上述結(jié)果的依據(jù)為血紅蛋白拉曼譜峰的初步歸屬分析結(jié)果。肺癌患者的譜峰之所以小于正常人，主要原因是上述三種振動模式數(shù)量的減少。另外，由于氧合血紅蛋白吡咯環(huán)以及氧合血紅蛋白分子乙烯基團(tuán)的振動會影響人氧合血紅蛋白平均 NIR?SERS光譜在1583 cm－1的譜峰變化，因此，當(dāng)肺癌患者新陳代謝紊亂、惡性腫瘤組織異常增大后，其氧合血紅蛋白分子乙稀基團(tuán)、氧合血紅蛋白吡咯環(huán)的構(gòu)象以及模式往往會產(chǎn)生變化，進(jìn)而異于健康人的譜峰移動情況［12］。

通過NIR?SERS光譜分析并對比兩組研究對象的氧合血紅蛋白情況，結(jié)果表明，兩組樣本氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜以及譜峰強(qiáng)度均存在明顯差異。相比于健康人，肺癌患者的氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜以及譜峰強(qiáng)度均相對較小。對上述現(xiàn)象的內(nèi)在原理加以分析后發(fā)現(xiàn)，肺癌患者的氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜以及譜峰強(qiáng)度之所以會減小，可能是由于惡性腫瘤組織異常增大所引發(fā)的，在這一過程中，患者上皮粘膜組織微血管的增生會直接引發(fā)其微血管含氧量的下降，進(jìn)而誘使腫瘤組織中氧合血紅蛋白含量降低［8］。上述變化能夠通過氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜情況來加以表征。

表2 氧合血紅蛋白的譜峰歸屬［8－11］

在本研究中，將NIR?SERS基底定為二維納米銀膜，對肺癌患者以及健康人進(jìn)行NIR?SERS光譜檢測分析。結(jié)果顯示，兩組研究對象的NIR?SERS光譜和譜峰強(qiáng)度均具備顯著差異，相比于健康人，在1583、816、473 cm－1處肺癌患者的氧合血紅蛋白 NIR?SERS光譜譜峰強(qiáng)度較小，正常人的氧合血紅蛋白平均NIR?SERS 光譜在 1208、1425 cm－1譜峰處肺癌患者分別紅移至1212、1432 cm－1，通過對氧合血紅蛋白平均NIR?SERS光譜分析，觀察到健康人在1583 cm－1的譜峰藍(lán)移到1579 cm－1。上述譜峰均與氧合血紅蛋白吡咯環(huán)和乙烯基團(tuán)（CaCm）的振動有關(guān)。對于肺癌患者的氧合血紅蛋白NIR?SERS光譜以及譜峰強(qiáng)度減小。因此通過肺癌組和對照組的譜峰強(qiáng)度變化揭示了氧合血紅蛋白NIR?SERS用于診斷肺癌的潛力。利用氧合血紅蛋白的NIR?SERS進(jìn)行肺癌或其他疾病的診斷是一項簡單快捷、生物兼容性好的技術(shù)，從一定程度上來講，NIR?SERS技術(shù)具備應(yīng)用于肺癌或其他疾病臨床診斷領(lǐng)域的潛力與價值。

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