周 寧，Philip F.Haines，段云友，王 滔

（1南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院超聲科，廣東深圳518100；2美國(guó)布朗大學(xué)，美國(guó)羅德島州02912；3空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院超聲科，陜西西安710038；4美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管研究所，美國(guó)賓夕法尼亞州19104）

0 引言

冠狀動(dòng)脈造影（coronary angiography，CAG）可以直接評(píng)估冠狀動(dòng)脈病變、狹窄程度，并且同時(shí)完成介入治療。雖然作為冠狀動(dòng)脈狹窄診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但它只能得到冠狀動(dòng)脈的解剖學(xué)評(píng)價(jià)，不能評(píng)價(jià)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)以及反映冠狀動(dòng)脈功能，并且是有創(chuàng)性檢查，因此其應(yīng)用受到限制。冠狀動(dòng)脈血流儲(chǔ)備（coro?nary flow reserve，CFR）是根據(jù)血流量增加的需求增加冠狀動(dòng)脈血流量的能力，它是最大充血血流量（H）與冠狀動(dòng)脈靜息（B）血流量的比值。CFR的測(cè)定可以評(píng)估冠狀動(dòng)脈狹窄程度，并可評(píng)估冠狀動(dòng)脈微循環(huán)的完整性和生理功能［1］。因此臨床醫(yī)生可以對(duì)整體疾病進(jìn)行更合理的診斷和治療，而不僅僅是判斷冠狀動(dòng)脈解剖學(xué)狹窄的程度。

高血壓心臟纖維化患者的心臟功能與CFR下降有關(guān)［2］。關(guān)于冠狀動(dòng)脈血流量和CFR的研究已經(jīng)在臨床開發(fā)中，但由于技術(shù)原因，在動(dòng)物模型中很少有研究報(bào)道。我們通過研究測(cè)量血管緊張素II（Ang II）和去氧腎上腺素（PE）誘導(dǎo)的心肌肥厚和纖維化小鼠的CFR，旨在獲得準(zhǔn)確和可重復(fù)的小鼠冠狀動(dòng)脈血流儲(chǔ)備的測(cè)量方法。我們希望通過本實(shí)驗(yàn)為臨床相關(guān)的心臟疾病和藥物治療效果評(píng)估提供一種無創(chuàng)、可重復(fù)的動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 用 Ang II［0.432 mg／（kg·d）］和 PE［50 mg／（kg·d）］處理 C57BL／6J小鼠以誘導(dǎo)心臟肥大和纖維化2周作為實(shí)驗(yàn)組?？瞻讓?duì)照組不作處理。實(shí)驗(yàn)組為10只Ang II＋PE處理的小鼠，對(duì)照組共8只，體質(zhì)量均為25～35 g。所有使用的方案均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理評(píng)估和認(rèn)證協(xié)會(huì)制定的指導(dǎo)方針，并獲得賓夕法尼亞大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法 仰臥于加熱平臺(tái)上的小鼠用

1%～2.5%異氟醚氣體和氧氣的混合物吸入麻醉。使用直腸溫度探針監(jiān)測(cè)小鼠的體溫，并在整個(gè)過程中使用紅外加熱燈使其體溫保持在（37.0±0.5）℃。 通過加熱平臺(tái)上的電極墊監(jiān)測(cè)ECG信號(hào)，兩點(diǎn)心電圖連接到小鼠的右上和左下肢。心電信號(hào)可在超聲心動(dòng)圖上實(shí)時(shí)顯示。ECG信號(hào)使得心臟收縮期和舒張期更容易被識(shí)別。使用化學(xué)脫毛劑（Nair）去除小鼠胸毛以減少超聲衰減。涂抹溫?zé)岬某曬詈蟿┑某暡ㄌ筋^（MS550D）置于小鼠胸部。

使用配備有MS550D換能器的高分辨率（40 MHz）Vevo 2100 成像系統(tǒng)（VisualSonics Inc.，Toronto，Canada）進(jìn)行經(jīng)胸二維（2D）和彩色多普勒超聲心動(dòng)圖研究。

1.3 經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖 從短軸切面和胸骨旁長(zhǎng)軸切面獲得乳頭肌水平的二維圖像。然后使用超聲儀自帶圖像分析軟件（Vevo 2100，1.6，VisualSonic）下載和分析超聲圖像。測(cè)量至少三個(gè)心動(dòng)周期，并對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行平均?；?D的M?模式成像從胸骨旁左心室短軸切面測(cè)量左心室（LV）舒張末期（LVIDd）和收縮末期內(nèi)徑（LVID）以及射血分?jǐn)?shù)（EF）和LV質(zhì)量。LV收縮功能通過LV EF和縮短率（FS，%）根據(jù)以下公式估算：FS（%）＝ ［（LVIDd－LVIDs）／LVIDd］×100%。

脈沖多普勒超聲心動(dòng)圖在心尖四腔切面進(jìn)行。將取樣容積放置在二尖瓣葉頂端的水平處，并且調(diào)整以測(cè)得二尖瓣多普勒流信號(hào)的最高舒張?jiān)缙诹魉俜逯?。舒張?jiān)缙诜逯邓俣龋‥，A）及其比值（E／A）由二尖瓣多普勒波形得出。

1.4 冠狀動(dòng)脈彩色多普勒超聲成像 除了用于評(píng)價(jià)心臟功能的超聲心動(dòng)圖成像的標(biāo)準(zhǔn)切面外，我們采用了一系列改進(jìn)并優(yōu)化的彩色多普勒成像技術(shù)顯示左冠狀動(dòng)脈（left coronary artery，LCA）。通過優(yōu)化圖像，血流與超聲波束之間的角度保持在20°以下。使用脈沖多普勒測(cè)量冠狀動(dòng)脈流速。測(cè)量的平均值是從三個(gè)連續(xù)的心動(dòng)周期計(jì)算的。測(cè)量平均舒張流速、峰值舒張流速和速度時(shí)間積分（velocity?time integral，VTI）。

使用彩色多普勒成像，LCA的近端部分可在三種不同切面中顯示。它們是LV長(zhǎng)軸切面、LV短軸切面和改良的五腔心切面。相比之下，改良的五腔心切面是最好的（圖1）。因?yàn)樗哂懈叩目芍貜?fù)性，并且LCA的顯示率更高。在我們獲得了經(jīng)典的四腔心切面之后，只需將探頭稍向小鼠的頭部移動(dòng)，在顯示肺動(dòng)脈之前，就可以得到改良的五腔心切面，我們可以看到LCA的近端部分。只有在這種切面下，我們才可以獲得聲束與血流之間的角度小于20°的多普勒信號(hào)。而在LV短軸切面，我們通?？梢钥吹絃CA主干的二維結(jié)構(gòu)，但有時(shí)因?yàn)榻嵌葐栴}無法獲得其內(nèi)的血流信號(hào)。在LV長(zhǎng)軸切面，由于角度問題（表1），LCA的VTI、峰值速度和平均速度的測(cè)量結(jié)果均低于我們從改良的五腔心切面獲得的結(jié)果。因此，我們選擇改良的五腔心切面作為L(zhǎng)CA的最終測(cè)量切面。

圖1 左冠狀動(dòng)脈三個(gè)檢查切面

表1 左室長(zhǎng)軸切面及改良的五腔心切面下基礎(chǔ)狀態(tài)及充血狀態(tài)下左冠狀動(dòng)脈測(cè)值

1.5 冠狀動(dòng)脈CFR檢測(cè) 通過面罩吸入3%的異氟烷誘導(dǎo)麻醉小鼠，之后保持在2%的濃度。將異氟醚濃度降至1%，在3 min后穩(wěn)定時(shí)獲取多普勒信號(hào)并將其存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)中，將所測(cè)數(shù)據(jù)冠脈流量作為基線水平（B）。然后異氟醚水平增加到2.5%，以增加冠脈流量，3 min后多普勒波形穩(wěn)定，存儲(chǔ)多普勒頻譜，所測(cè)數(shù)據(jù)作為充血后水平（H）。按照前述方法分別獲得基線及充血狀態(tài)下LCA的多普勒頻譜。我們建議在整個(gè)過程中使用控制臺(tái)系統(tǒng)而不是用手來控制探頭。只有這樣，才能較一致且穩(wěn)定地獲得LCA的多普勒頻譜。如果在3 min內(nèi)用手握住探頭，則很難將探頭保持在同一點(diǎn)。值得注意的是，當(dāng)將異氟醚減少至1%時(shí)，有時(shí)候小鼠會(huì)有清醒的趨勢(shì)，可能會(huì)有移動(dòng)，這時(shí)需要調(diào)整探頭的位置以獲得LCA圖像。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)值均以±s表示。使用t檢驗(yàn)分析組間差異。對(duì)于所有分析（Prism 5，GraphPad?Inc，San Diego，CA），P＜0.05 時(shí)被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組小鼠心肌肥大及纖維化 Ang II＋PE處理的小鼠與對(duì)照組相比發(fā)生中度心肌肥厚，小鼠心肌重量增加，EF正常，舒張功能障礙表現(xiàn)為二尖瓣 E減低（P＜0.05，表2）。

表2 在未處理的空白對(duì)照組小鼠和Ang II＋PE處理的小鼠心臟相關(guān)測(cè)量值

2.2 小鼠左冠狀動(dòng)脈CFR測(cè)量結(jié)果 左冠狀動(dòng)脈近端血流在改良的五腔心切面可以較好地被測(cè)量（圖2）。Ang II＋PE處理的小鼠在充血狀態(tài)下舒張期峰值速度（PDV），平均速度和VTI降低。CFR（PDV，平均速度和VTI的H／B比）顯著降低（表3）。

圖2 左冠狀動(dòng)脈血流頻譜

3 討論

由于冠狀動(dòng)脈很小，位于胸腔深處并且由于它們附著于心外膜表面而處于恒定運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，因此超聲波對(duì)于冠狀動(dòng)脈血流的無創(chuàng)測(cè)量是困難的。本研究證明，無創(chuàng)左冠狀動(dòng)脈血流和CFR評(píng)估在不使用藥物誘導(dǎo)冠脈血流儲(chǔ)備發(fā)生變化的小鼠中是可行的。使用高頻超聲心動(dòng)圖技術(shù)可以較容易地測(cè)量小鼠LCA近端血流。

表3 在未處理的空白對(duì)照組小鼠和Ang II＋PE處理的小鼠中基礎(chǔ)狀態(tài)和充血狀態(tài)下的左冠狀動(dòng)脈CFR

左主干冠狀動(dòng)脈多普勒頻譜的典型表現(xiàn)是舒張期主導(dǎo)的血流頻譜。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈血流頻譜可以在三種不同的切面中獲得，它們分別是左室長(zhǎng)軸切面、短軸切面和改進(jìn)的五腔心切面。相比之下，改良的五腔心切面被認(rèn)為是測(cè)量左主干冠狀動(dòng)脈的最佳切面。在改良的五腔心切面觀察中獲得的冠狀動(dòng)脈血流速度的測(cè)量結(jié)果高于其他兩個(gè)切面中的測(cè)量結(jié)果，并且顯示率也較高。在長(zhǎng)軸和短軸切面中，聲束與血流之間的角度通常超過20°，導(dǎo)致血流速度測(cè)量誤差；特別是在短軸切面左冠狀動(dòng)脈起始段大部分時(shí)間內(nèi)幾乎與聲束相互垂直時(shí)，只能觀察到二維的LCA結(jié)構(gòu)圖像，但無法獲得血流圖像；即使得到LCA的多普勒頻譜，但得到的LCA的速度和VTI要比它在改良的五腔心切面中得到的要低。在改良的五腔心切面，LCA血流與超聲波束之間的角度基本上可以小于20°，并且顯示率可以達(dá)到100%。

CFR是最大冠狀動(dòng)脈充血流量與基線血流的比值，使用經(jīng)胸多普勒超聲心動(dòng)圖（transthoracic doppler echocardiography，TTDE）評(píng)估，已用于臨床評(píng)估冠狀動(dòng)脈狹窄嚴(yán)重程度［1］和檢測(cè)心肌微血管功能障礙［3］。臨床TTDE CFR方案也適用于小鼠實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的左冠狀動(dòng)脈最小管腔直徑［4］以及心肌炎模型中的微血管功能障礙［5］。Wikstr?m等［6］使用經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖評(píng)估腺苷誘導(dǎo)的小鼠冠狀動(dòng)脈血流儲(chǔ)備。他們發(fā)現(xiàn)，CFR似乎是用于評(píng)估小鼠體內(nèi)冠狀動(dòng)脈功能的更可靠的方法。在該項(xiàng)研究中，他們使用腺苷來獲得冠狀動(dòng)脈血流的充血狀態(tài)。

給予特定的冠狀血管舒張劑如腺苷［7－8］是評(píng)估冠狀動(dòng)脈血流儲(chǔ)備所必需的，已經(jīng)應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)中，但這在靜脈更難以插管并且耐受劑量和容量更小的小鼠中更成問題。有人偶然地發(fā)現(xiàn)，最廣泛使用的麻醉劑之一——異氟烷氣體在較高濃度下也是冠狀血管擴(kuò)張劑［9］。使用吸入性冠狀血管舒張劑，如果有效并且耐受性良好，將大大簡(jiǎn)化對(duì)小鼠冠狀動(dòng)脈血流儲(chǔ)備的檢測(cè)，并使該方法真正無創(chuàng)。2010年，Hart?ley等［10］發(fā)現(xiàn)，通過將異氟醚氣體麻醉的濃度從1%改變?yōu)?.5%，冠狀動(dòng)脈血流速度可以從基線（B）增加至充血（H）水平，并且H水平與腺苷誘導(dǎo)的相似或更高。他們?cè)趯?shí)驗(yàn)中將探頭放置在小鼠左側(cè)胸部，并將取樣容積放置于深度2.5 mm處，朝向左主冠狀動(dòng)脈的起點(diǎn)。冠狀動(dòng)脈血流信號(hào)多普勒頻譜在顯示器上通過流向?yàn)槌蛱筋^的舒張?jiān)缙诜逯笛鬟M(jìn)行識(shí)別。在該研究中，他們通過移動(dòng)探頭發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈血流波形譜時(shí)識(shí)別冠狀動(dòng)脈，而不是直接觀察冠狀動(dòng)脈血流，因此結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)偏差。在本研究中，我們吸取以往研究的優(yōu)點(diǎn)，使用不同的異氟醚濃度來獲得B和H水平，而不使用藥理學(xué)試劑；并通過比較，選擇了LCA測(cè)量的最佳切面，可以直接觀察到冠狀動(dòng)脈，獲得較為準(zhǔn)確的冠狀動(dòng)脈血流參數(shù)。證實(shí)了通過經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖這種無創(chuàng)的檢查手段獲得LCA起始段的血流頻譜，且該方法的可行性和可重復(fù)性較好。

有研究［11］表明，臨床患者的冠狀動(dòng)脈CFR顯示率高達(dá)95%～100%，具有良好的可行性和可重復(fù)性。在本研究中，冠狀動(dòng)脈左支起始段CFR在改良的五腔心切面觀察中的檢測(cè)成功率在小鼠中也提高到了100%，并且與報(bào)道的一致。小鼠的靜脈難以插管并且耐受劑量和容量更小，因此，以往對(duì)于使用臨床使用腺苷之類藥物誘導(dǎo)檢測(cè)冠狀動(dòng)脈在小鼠動(dòng)物模型中較難實(shí)現(xiàn)。通過本實(shí)驗(yàn)避免了靜脈使用腺苷等藥物誘導(dǎo)，且在實(shí)驗(yàn)室大部分的小鼠模型的麻醉方法均為使用吸入用異氟醚麻醉，通過吸入面罩調(diào)節(jié)劑量在實(shí)驗(yàn)中也十分方便。在本實(shí)驗(yàn)中，我們成功檢測(cè)到，使用Ang II＋PE處理的心肌肥大及纖維化小鼠的左冠狀動(dòng)脈CFR明顯減低。

4 結(jié)論

在不使用藥物的情況下，無創(chuàng)冠狀動(dòng)脈血流儲(chǔ)備評(píng)估在小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭惺强尚械?。通過本實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，可以建立臨床相關(guān)的心臟疾病小鼠動(dòng)物模型，并通過經(jīng)胸彩色多普勒超聲對(duì)動(dòng)物模型的冠狀動(dòng)脈血流儲(chǔ)備進(jìn)行監(jiān)測(cè)，為疾病的診斷、藥物或其他治療方法的效果評(píng)估提供一種無創(chuàng)、可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)方法。

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