苑志欣，李榮貴，鄭蘭紅

（1.青島大學 生命科學學院，山東青島 266071；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開發(fā)重點實驗室 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071）

海洋微生物作為抗腫瘤活性物質(zhì)的新來源，已經(jīng) 受到了全世界海洋研究工作者的關(guān)注。滸苔是一種重要的海洋資源，含有豐富的碳水化合物、氨基酸、微量元素、維生素和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)，具有降血糖、抗菌消炎、抗腫瘤活性、提高免疫力的作用[1]。本研究采用細胞毒活性檢測法，從滸苔共生菌中篩選出一株具有抗腫瘤活性的菌株Raoultella sp. HT15-8，對其次級代謝產(chǎn)物進行了初步的分離純化，得到的抗腫瘤粗提物對兩種腫瘤細胞都具有良好的抗腫瘤活性。本文結(jié)合具體實驗與分析方法作一探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培養(yǎng)基

Raoultella sp.HT15-8，由本實驗室從青島海域的滸苔中分離得到。發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，pH=7.5，121 ℃滅菌30 min。

1.1.2 細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞BEL-7402、人非小細胞肺癌細胞A549均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；人肝癌細胞BEL-7402細胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基，人非小細胞肺癌細胞A549采用RPMI1640培養(yǎng)基；將各腫瘤細胞接種于含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM、RPMI1640培養(yǎng) 液 中，置 于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑

RPMI1640、DMEM、PBS、胰蛋白酶、進口胎牛血清、DMSO，購自Solarbio公司；16S rRNA通用引物，由上海生工生物工程有限公司合成；PCR擴增相關(guān)試劑和核酸Marker，購自索萊寶生物工程公司；MTT，購自Sigma公司；微孔濾膜，購自美國Pall公司；甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇、Tris、鹽酸等常用試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為超純水和蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選

從青島海域撈取新鮮滸苔瀝干，將其研磨粉碎成漿，分別采用海水基礎(chǔ)培養(yǎng)基2216E、LB培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基等對滸苔樣品進行多次選擇性的稀釋、涂布、劃線和分離培養(yǎng)，共獲得10株單菌落。

1.2.2 菌種鑒定

（1）形態(tài)觀察。將活性初篩得到的HT15-8接于牛肉膏蛋白胨平板上，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，體式顯微鏡下觀察菌落及子實體形態(tài)。

（2）生理生化特征觀察。采用API 20E腸桿菌和其他革蘭陰性桿菌鑒定系統(tǒng)和API 20NE非腸道革蘭陰性桿菌鑒定系統(tǒng)和氧化酶試紙測定生理生化特征。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察活性組分對細胞形態(tài)的影響

取對數(shù)生長期的細胞，將細胞制成濃度為4×104個/mL的細胞懸液，均勻鋪在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入180 μL，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。參考MTT實驗結(jié)果加樣，4個平行孔，每孔加入20μL樣品，對照組加入無菌水，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、36 h后，取出放置在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，并拍照記錄。

1.2.4 活性粗提物的分離純化

（1）菌株的發(fā)酵培養(yǎng)。將實驗室保藏的菌株HT15-8先轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基活化后，用接種環(huán)挑取單菌落接種于4 mL種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min的搖床中恒溫培養(yǎng)12 h，即為種子培養(yǎng)液；然后按照4%的接種量將活化后的種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于含發(fā)酵培養(yǎng)基400 mL的大搖瓶中，離心去菌體收集上清發(fā)酵液。

（2）有機溶劑萃取。將各菌株發(fā)酵液在12 000 r/min條件下離心20 min后收集上清液，超濾濃縮后加入等體積的有機溶劑甲醇、丙酮、乙酸乙酯、水飽和正丁醇進行萃取，每次萃取4 h，多次萃取后收集上層有機相，然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將收集到的萃取相在60 ℃條件下減壓蒸干。減壓蒸干的樣品經(jīng)重溶、離心、凍干后，檢測發(fā)酵活性組分的抗腫瘤活性。

（3）離子交換色譜分離。將得到的活性組分用盡量少的Tris-HCl緩沖液復溶后，進行離子交換色譜分離。采用陽離子交換色譜柱CM柱進行交換分離，將收集到的樣品進行透析除鹽凍干，分別測定其細胞毒活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

初篩實驗表明，對肝癌細胞BEL-7402的抑制率達到50%以上的滸苔共生微生物有4株，其中HT15-8菌株的發(fā)酵液具有最強的腫瘤細胞增殖抑制作用，并將該菌株于2016年9月30日保藏于中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCM2016507。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)特征

HT15-8菌落呈圓形，表面光滑濕潤，易挑起，菌落質(zhì)地均勻，正反面、邊緣以及中央部分的顏色很均一，菌落顏色為乳白色，屬于革蘭氏陰性菌。

2.2.2 生理生化特征

HT15-8的生理生化特征實驗結(jié)果見表1，脲酶、色氨酸脫氫酶、明膠酶均顯示陰性；β-半乳糖苷酶、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、H2S產(chǎn)生、吲哚實驗、VP實驗、氧化酶試驗均顯示陽性。

表1 Raoultella sp. HT15-8菌株的生理生化特征

2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

對HT15-8進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果有亮色條帶出現(xiàn)，說明PCR成功，可用于后續(xù)測序。在NCBI上經(jīng)過BLAST分析，結(jié)果表明HT15-8屬于拉烏爾菌屬，命名為Raoultella sp. HT15-8，與Raoultella planticola ATCC 33531在同一分支上，在進化位置上最為接近。利用Mega 6.0的Kimura-2-Parameter模型，運用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.3 活性粗提物的純化

2.3.1 萃取分離

菌株HT15-8發(fā)酵液經(jīng)不同有機溶劑萃取后，對BEL-7402腫瘤細胞進行細胞毒活性檢測，其中甲醇、丙酮和乙酸乙酯對發(fā)酵液中目的產(chǎn)物的抗腫瘤活性影響較大，而正丁醇對發(fā)酵上清液的抗腫瘤活性影響較小，可以很好地將目的產(chǎn)物萃取出來。

萃取組分300μg/mL 甲醇 甲醇 正丁醇 乙酸乙酯抑制率/% 21 13 74 22

2.3.2 離子交換色譜分離抗腫瘤活性物質(zhì)

將萃取得到的粗提物用盡量少的水復溶后，進行離子交換色譜分離。分別用陰離子交換色譜HiTrap DEAE FF、HiPrep Q FF 16/10和陽離子交換色譜HiTrap CM FF置換分離，結(jié)果顯示陽離子色譜HiTrap CM FF可以較好地將目的產(chǎn)物置換出來。得到的分離結(jié)果如圖1，共收集到3個穿透峰，只有峰P3的凍干液有活性。

圖1 離子交換色譜分離抗腫瘤活性組分

2.3.3 粗提物的抗腫瘤活性

將HiTrap CM FF離子交換色譜所分離得到的活性粗提物濃縮成一定濃度，分別作用于BEL-7402和A549，無菌水作為陰性對照，相同條件下作用24 h后，可以觀察到對照中的腫瘤細胞正常生長，不受任何影響。而加藥組的腫瘤細胞增殖受到抑制，均出現(xiàn)變圓皺縮聚團現(xiàn)象，同時部分細胞還出現(xiàn)裂解凋亡狀態(tài)。

圖3 活性粗提物對BEL-7402和A549作用24h后的形態(tài)變化

3 討論

隨著人們生活質(zhì)量的提高和對身體健康的日益重視，對于開發(fā)高效、低毒的小分子抗腫瘤藥物的需求也變得日益迫切。本實驗以滸苔為研究對象，對10株滸苔共生微生物進行發(fā)酵培養(yǎng)，采用細胞毒活性（MTT）法，對代謝產(chǎn)物進行了抗腫瘤活性的重點篩選，從倒置顯微鏡下觀察分析發(fā)現(xiàn)，滸苔拉烏爾菌Raoultella sp. HT15-8代謝產(chǎn)物的活性組分能夠明顯抑制腫瘤細胞的正常增殖并最終導致其凋亡[2]。通過對菌株HT15-8進行形態(tài)觀察、生理生化實驗鑒定和16S rRNA基因序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)為拉烏爾菌屬（Raoultella sp.），通過倒置顯微鏡觀察菌株Raoultella sp. HT15-8代謝產(chǎn)物的活性組分對 BEL-7402、A549細胞形態(tài)的影響，結(jié)果顯示株菌HT15-8的活性組分可以改變腫瘤細胞形態(tài)，抑制腫瘤細胞增殖。

進一步采用水飽和正丁醇萃取制備滸苔微生物的代謝產(chǎn)物，隨后通過陽離子交換色譜HiTrap CM FF對該粗提物進行蛋白分離純化，得到1個較純的單峰物質(zhì)，體外腫瘤細胞實驗結(jié)果顯示該組分具有廣譜高效的抗腫瘤活性。該實驗表明，HT15-8有開發(fā)成抗腫瘤新藥物的潛在價值，為新型先導化合物的發(fā)現(xiàn)提供了新的微生物種質(zhì)資源。

[1]曹雪,楊瑞麗,袁獻溫,等.海洋放線菌ACMA006抗腫瘤活性成分的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定[J].臺灣海峽,2011，30(3):400-404.

[2]孫坤來,王義,付鵬,等.滸苔共生真菌HT-2次生代謝產(chǎn)物的研究[J].中國海洋藥物,2013,32(1):37-45.