余佳佳， 劉婧嫻， 李媛睿， 俞 靜， 劉 瑛

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200092）

肺炎克雷伯菌是腸桿菌科細(xì)菌中常見的病原菌之一，臨床分離率高達(dá)14%[1]。目前肺炎克雷伯菌的耐藥形勢(shì)越來(lái)越嚴(yán)峻，對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率在10%以上[1-2]。對(duì)于此類耐藥菌，經(jīng)驗(yàn)性單一抗菌藥物的使用可能會(huì)導(dǎo)致抗感染治療失敗[3]。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）的主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶。我國(guó)流行的CRKP 70%以上為ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌[4-5]。因此，及時(shí)、快速地檢測(cè)該型別肺炎克雷伯菌對(duì)指導(dǎo)臨床抗菌藥物的使用和控制院內(nèi)耐藥性的傳播有重要意義。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization timeof-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是近幾年來(lái)用于微生物鑒定的有效工具，因具有快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)使其在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室得到廣泛應(yīng)用。根據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，MALDITOF MS除了可以用于細(xì)菌種屬鑒定外，還具有鑒別亞型的潛力[5-9]。本研究旨在利用MALDITOF MS篩選出ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的特異峰，從而在微生物實(shí)驗(yàn)室臨床常規(guī)鑒定工作中可快速檢測(cè)該型別肺炎克雷伯菌。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 選取2009—2016年上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室前期收集并已進(jìn)行碳青霉烯酶基因檢測(cè)以及多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）的肺炎克雷伯菌207株，其中118株（ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌67株，非該型別的肺炎克雷伯菌51株）作為特異峰篩選組；89株（ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌37株，非該型別的肺炎克雷伯菌52株）作為特異峰驗(yàn)證組，其中9株產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院（5株ST423型，2株ST65型，1株ST11型）和上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院（1株ST11型）提供。隨機(jī)收集2016年10月—2017年2月MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果為肺炎克雷伯菌且質(zhì)譜評(píng)分＞2.00的臨床分離菌95株，用于評(píng)估特異峰的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1.1.2 試劑和儀器 甲酸和乙腈購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸（alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA）基質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)蛋白校準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Bruker Daltonik公司；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司，PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。Microflex LT質(zhì)譜儀、96孔金屬靶板、Flex control 3.0軟件、MicroFlex Biotyper 3.0鑒定分析軟件、Clinpro Tools 3.0軟件以及Flex analysis 3.0圖譜分析軟件均購(gòu)自德國(guó)Bruker Daltonik公司；Mastercycler EP Gradient Thermal Cycler PCR儀和微量移液器購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 特異峰篩選試驗(yàn) （1）質(zhì)量圖譜的獲?。簩?80 ℃保存的118株肺炎克雷伯菌在室溫下復(fù)蘇后接種至麥康凱平板上，35 ℃孵育16～24 h，然后挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)種于血平板，35 ℃孵育16～24 h后挑取單個(gè)菌落混于70%（V/V）的乙醇溶液中，3 000×g離心5 min后去上清，在菌落沉淀中加入甲酸、乙腈混合溶液（1∶1），裂解細(xì)菌，取1 μL裂解液加入96孔靶板，自然干燥后加入1 μL HCCA基質(zhì)，自然干燥后進(jìn)行MALDI-TOF MS檢測(cè)。利用Flex control 3.0軟件獲得質(zhì)量圖譜并保存，校準(zhǔn)物質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白校準(zhǔn)品。參數(shù)設(shè)置：m/z范圍2 000～20 000，shots 200，激光強(qiáng)度80%。將圖譜導(dǎo)入MicroFlex Biotyper 3.0鑒定分析軟件，與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，當(dāng)鑒定結(jié)果為肺炎克雷伯菌且質(zhì)譜評(píng)分＞2.30時(shí)，再利用Flex analysis 3.0圖譜分析軟件對(duì)質(zhì)譜峰圖進(jìn)行曲線光滑去噪及基線去除處理。（2）特異峰的篩選：將118株肺炎克雷伯菌中67株ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的圖譜作為A組，51株非該型別的肺炎克雷伯菌的圖譜作為B組，導(dǎo)入Clinpro Tools 3.0軟件，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，獲得按照統(tǒng)計(jì)學(xué)意義排列的質(zhì)量峰列表；繪制排名前5位質(zhì)量峰的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，比較曲線下面積（area under curve，AUC）；通過(guò)主成分分析（principal component analysis，PCA）獲得A組和B組的散點(diǎn)分布圖，綜合以上條件確定ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的最特異峰，并通過(guò)Flex analysis 3.0圖譜分析軟件對(duì)挑選出的特異峰進(jìn)行肉眼觀察。

1.2.2 特異峰驗(yàn)證和重復(fù)性試驗(yàn) 按照上述操作步驟獲得特異峰驗(yàn)證組89株肺炎克雷伯菌的質(zhì)量圖譜，導(dǎo)入Flex analysis 3.0圖譜分析軟件。采用肉眼觀察特異峰的方法對(duì)菌株進(jìn)行分類，并從中隨機(jī)挑選出60株肺炎克雷伯菌（ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌及非該型別肺炎克雷伯菌各30株）。在血平板上獲得新鮮菌落后，挑取3個(gè)單菌落分別進(jìn)行裂解，取1 μL單菌落的裂解液點(diǎn)樣在金屬靶板孔位上，分別在每個(gè)孔位的3個(gè)不同位置獲取圖譜，則1株菌共有9個(gè)質(zhì)量圖譜，將圖譜導(dǎo)入Flex analysis 3.0圖譜分析軟件，肉眼觀察是否存在特異峰，計(jì)算特異峰的重復(fù)性。

1.2.3 臨床應(yīng)用評(píng)估 隨機(jī)收集2016年10月—2017年2月日常工作中MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果為肺炎克雷伯菌且質(zhì)譜評(píng)分＞2.00的臨床菌株95株，觀察其臨床鑒定圖譜是否具有特異峰，并對(duì)所有菌株進(jìn)行碳青霉烯酶基因檢測(cè)和MLST，從而計(jì)算特異峰的特異性和敏感性。

1.2.4 碳青霉烯酶基因檢測(cè)和MLST 利用PCR檢測(cè)用于臨床評(píng)估的95株肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因blaKPC-2、blaGES、blaIMP-1、blaIMP-2、blaVIM-1、blaVIM-2、blaNDM-1和blaOXA-48[10]，并對(duì)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對(duì)。根據(jù)MLST網(wǎng)站（http：//bigsdb.web.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html）的推薦，采用PCR檢測(cè)肺炎克雷伯菌的7個(gè)管家基因，即gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與MLST databases進(jìn)行比對(duì)后獲得等位基因組合所對(duì)應(yīng)的ST型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Clinpro Tools 3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用表達(dá)，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 特異峰篩選

特異峰篩選組菌株的碳青霉烯酶基因類型和MLST見表1。118株肺炎克雷伯菌的圖譜在Clinpro Tools 3.0軟件中通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析獲得質(zhì)量峰列表，其中排名前5位的質(zhì)量峰分別為m/z 4 521、4 510、2 763、6 514和4 648。排名第1位的質(zhì)量峰m/z 4 521，A組平均信噪比是5.74±2.69，B組平均信噪比是0.67±0.31，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），變異系數(shù)為46.88%。質(zhì)量峰的ROC曲線見圖1，其中質(zhì)量峰m/z 4 521的AUC最大，為1.000。雖然質(zhì)量峰m/z 2 763的AUC為0.998，但由于變異系數(shù)為62.31%，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義低于m/z 4 510（AUC=0.947，變異系數(shù)=31.38%）。通過(guò)主成分分析獲得A組和B組的特異峰信噪比分析圖（圖2），圖中可看出在m/z 4 521的方向，A組和B組間分界明顯，而在m/z 4 510方向A組和B組有較多重合。

將特異峰篩選組菌株的質(zhì)量圖譜導(dǎo)入Flex analysis 3.0圖譜分析軟件，并將質(zhì)量圖譜進(jìn)行局部放大，m/z分析范圍設(shè)定為4 300～5 200，設(shè)定確認(rèn)特異峰存在的條件為：信噪比＞3.000，容忍度為m/z ±3。

表1 118株特異峰篩選組菌株的碳青霉烯酶基因類型和MLST

圖1 質(zhì)量峰m/z 4 521、2 763、4 510、6 514和4 648的ROC曲線

圖2 ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌和其他型別肺炎克雷伯菌特異峰信噪比分析

2.2 特異峰的驗(yàn)證和重復(fù)性試驗(yàn)

89株肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因類型和MLST見表2。將所有質(zhì)量圖譜導(dǎo)入Flex analysis 3.0圖譜分析軟件，若肉眼觀察存在特異峰m/z 4 521，則判斷此菌株為ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌，未出現(xiàn)該特異峰，則判斷為其他型別肺炎克雷伯菌（圖3）。肉眼觀察特異峰分類方法的敏感性為97.3%（36/37），特異性為98.1%（51/52）。

表2 89株特異峰驗(yàn)證菌株的碳青霉烯酶基因型別和MLST

圖3 不同型別肺炎克雷伯菌的MALDI-TOF MS質(zhì)量圖譜

用于重復(fù)性分析的30株ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌共有270個(gè)質(zhì)量圖譜，其中有7個(gè)圖譜（分別屬于不同的菌株）無(wú)特異峰m/z 4 521，其余263個(gè)圖譜均有該特異峰，該特異峰重復(fù)率為97.4%（263/270）。另外30株非該型別肺炎克雷伯菌的270個(gè)質(zhì)量圖譜均無(wú)特異峰m/z 4 521。

2.3 臨床應(yīng)用評(píng)估

2016年10月—2017年2月共收集了95株肺炎克雷伯菌及其臨床鑒定圖譜，菌株的碳青霉烯酶基因和MLST檢測(cè)結(jié)果見表3，其中ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌32株，非該型別肺炎克雷伯菌63株，肉眼觀察臨床鑒定圖譜是否存在特異峰m/z 4 521的方法對(duì)ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌進(jìn)行鑒別的特異性為95.2%（60/63），敏感性為96.9%（31/32）。

表3 95株臨床菌株碳青霉烯酶基因型別及MLST

3 討論

碳青霉烯類藥物是治療腸桿菌科細(xì)菌重癥感染的一線抗菌藥物，但近年來(lái)CRKP的檢出率日益增加，CRKP對(duì)包括碳青霉烯類在內(nèi)的多種不同類型抗菌藥物廣泛耐藥，從而導(dǎo)致臨床治療失敗，嚴(yán)重威脅患者生命。根據(jù)耐藥機(jī)制研究和流行病學(xué)分析可知，我國(guó)CRKP的主要流行株為ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌。目前檢測(cè)肺炎克雷伯菌產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶的金標(biāo)準(zhǔn)是PCR，而確定其ST型則需對(duì)特定保守基因進(jìn)行DNA測(cè)序，這2種方法都較為繁瑣，需要特殊的試劑和儀器，且對(duì)操作人員有較高的要求，在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室無(wú)法得到常規(guī)開展。MALDI-TOF MS在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室已常規(guī)用于病原菌鑒定，具有快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)質(zhì)量圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，可獲得細(xì)菌的種屬信息。質(zhì)量圖譜中包含的蛋白質(zhì)的表達(dá)信息不僅可用于種屬鑒定，對(duì)細(xì)菌的進(jìn)一步分型也具有指導(dǎo)作用。

本研究采用MALDI-TOF MS對(duì)ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌和其他型別的肺炎克雷伯菌進(jìn)行比對(duì)分析，篩選出ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的特異峰m/z 4 521。通過(guò)對(duì)特異峰m/z 4 521進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)利用該特異峰檢測(cè)ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌有很高的特異性和敏感性，并且該特異峰重復(fù)性很高，因此在日常臨床工作中可根據(jù)分離菌的單個(gè)鑒定圖譜是否有特異峰m/z 4 521快速檢測(cè)ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌。該方法快速、簡(jiǎn)便且不需要增加額外的儀器、試劑、費(fèi)用和工作量等。

本研究包含了各種型別肺炎克雷伯菌，除了ST11型產(chǎn)KPC-2、其他ST型產(chǎn)KPC-2、ST11型不產(chǎn)碳青霉烯酶以及其他ST型產(chǎn)其他碳青霉烯酶的CRKP外，還包括了對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物敏感的其他ST型菌株，基本包含了臨床中分離的所有型別肺炎克雷伯菌。較多的菌株數(shù)量和豐富的菌株型別充分證明質(zhì)量峰m/z 4 521是ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的特異峰。

本研究在進(jìn)行特異峰篩選和驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)，對(duì)菌株孵育時(shí)間、接種平板種類、裂解方法以及質(zhì)譜參數(shù)都進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定，確保獲得的鑒定圖譜評(píng)分＞2.30，使細(xì)菌準(zhǔn)確鑒定至種水平。由于麥康凱平板上生長(zhǎng)的肺炎克雷伯菌形態(tài)更易與其他腸桿菌科細(xì)菌區(qū)分，本實(shí)驗(yàn)室在臨床日常工作中常規(guī)利用MALDI-TOF MS直接對(duì)麥康凱平板上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，并且根據(jù)質(zhì)譜儀廠商規(guī)定，鑒定圖譜評(píng)分只需＞2.00，即可將菌株鑒定至種水平，因此日常工作中質(zhì)量圖譜的獲取很難按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件進(jìn)行。為了確保利用特異峰m/z 4 521的存在與否來(lái)判斷菌株是否為ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的方法具有臨床應(yīng)用價(jià)值，本研究對(duì)95株肺炎克雷伯菌的常規(guī)臨床鑒定圖譜進(jìn)行了特異峰觀察，發(fā)現(xiàn)該方法的特異性和敏感性均＞95.0%。由此證明在臨床日常工作中，即使是未按照試驗(yàn)條件而獲取的質(zhì)量圖譜，也可根據(jù)特異峰m/z 4 521的存在與否，快速、準(zhǔn)確地判斷菌株是否為ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌。

本研究對(duì)特異峰進(jìn)行了臨床應(yīng)用價(jià)值評(píng)估，發(fā)現(xiàn)在2株ST11型不產(chǎn)碳青霉烯酶和1株ST29型不產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌的臨床鑒定圖譜中存在特異峰m/z 4 521，1株ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的臨床圖譜中并不存在特異峰m/z 4 521，這些菌株按照試驗(yàn)條件重新獲取圖譜后觀察到特異峰，結(jié)果與臨床鑒定圖譜一致。本研究還對(duì)這4株菌重新進(jìn)行了紙片擴(kuò)散法藥物敏感性試驗(yàn)、改良Hodge試驗(yàn)以及碳青霉烯酶失活試驗(yàn)，檢測(cè)耐藥表型和碳青霉烯酶活性，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果與碳青霉烯酶基因檢測(cè)結(jié)果相符。由于質(zhì)量峰m/z 4 521是ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的特異峰，故推測(cè)該特異峰對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)可能參與ST11型肺炎克雷伯菌產(chǎn)生并分泌KPC-2型碳青霉烯酶的過(guò)程，且編碼基因有可能位于質(zhì)粒上，因此出現(xiàn)上述2種情況的原因可能是含有特異峰對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)編碼基因的質(zhì)粒穩(wěn)定性略差，在傳代過(guò)程中有可能發(fā)生丟失和傳播，這還有待后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)。

據(jù)報(bào)道，日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的特異峰m/z 11 109，該特異峰的本質(zhì)為PKPQIL-p019蛋白，編碼該蛋白的基因與blaKPC毗鄰位于PKPQIL型質(zhì)粒的Tn4401轉(zhuǎn)座子內(nèi)[11-12]。但該質(zhì)粒僅在日本流行，在其他地區(qū)流行的不攜帶該質(zhì)粒的產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌無(wú)法檢測(cè)到該特異峰[13]。在本實(shí)驗(yàn)室獲得的鑒定圖譜中亦未發(fā)現(xiàn)特異峰m/z 11 109，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)本地區(qū)產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌blaKPC主要位于IncFⅡ或IncX質(zhì)粒上的Tn1721和Tn3轉(zhuǎn)座子內(nèi)[7]。因此我們推測(cè)，對(duì)于遺傳背景不同的菌株，其特異峰也不盡相同。在本研究中，我們納入了復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院和上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院的菌株，試驗(yàn)結(jié)果表明，利用特異峰m/z 4 521存在與否來(lái)鑒別菌株是否為ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的方法在上海地區(qū)可能具有普遍適用性。該方法具有快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)和適用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此在區(qū)域流行病學(xué)研究中有良好的應(yīng)用前景。

綜上所述，本研究利用MALDI-TOF MS篩選出ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌的特異峰m/z 4 521，并且驗(yàn)證了該特異峰具有良好的臨床應(yīng)用前景。該特異峰可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)ST11型產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌，對(duì)此類臨床常見型別肺炎克雷伯菌的用藥指導(dǎo)和流行病學(xué)研究有重要的意義。

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