單洪波， 金亞南

（1. 杭州艾迪康醫(yī)學檢驗中心，浙江 杭州 310023；2. 杭州優(yōu)思達生物技術有限公司，浙江 杭州 310053）

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指在基因組水平上，特定核苷酸位置上存在2種或2種以上不同的堿基，且其中任何一種等位基因在群體中的頻率不＜1%。SNP是一種單堿基水平的分子遺傳標記，不僅可通過連鎖或關聯(lián)分析來定位疾病易感基因，而且有些SNP本身就可能會導致某些疾病或引起個體對藥物反應的差異[1]。同時，SNP圖譜的建立還能有效地幫助破解人類生理學密碼，了解人類進化的起源以及對患者進行有效的治療[2]。因此，SNP檢測對疾病的風險性評估、診斷、預防和治療等各方面均有很大的價值。

目前已報道了多種檢測SNP的方法用于基因檢測和藥物基因組學的研究[1]。引物特異性聚合酶鏈反應（allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR）是目前比較常見的一種SNP檢測技術，具體指通過設計針對不同SNP位點基因型的特異性引物達到特異性擴增和檢測的目的[3-4]。改進的AS-PCR也包括引物擴增受阻突變體系聚合酶鏈反應（tetraprimer amplif i cation refractory mutation systempolymerase chain reaction，T-ARMS-PCR）[5-6]和溫度開關（temperature-switch polymerase chain reaction，TSP）等[7-8]。但目前這些方法的產物往往只能通過溶解曲線和電泳進行檢測。這些檢測技術不僅需要比較昂貴的儀器，還容易導致擴增產物之間的交叉污染[9-10]。鑒于SNP檢測的重要意義，本研究結合聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）和位點特異性引物延伸反應（allele-specific extension，ASE）的優(yōu)點對有關SNP位點的基因型進行檢測，探討PCR-ASE在SNP基因型檢測方面的應用可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

Taq DNA 聚合酶以及所有的外圍擴增引物（PF和PR）、ASE引物和探針均購于生工生物工程（上海）有限公司；引物和探針的有關信息見表1。ASE引物和探針的二級結構以及相互之間的雜交關系可通過Integrated DNA Technologies 公司的引物設計軟件（http：//eu.idtdna.com/pages/scitools）進行分析，以避免假陽性的出現(xiàn)。在針對不同SNP位點進行檢測時，需設計2條PCR外圍擴增引物，其退火溫度為66～76 °C；相關的ASE引物的5'端需標記異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）或者地高辛（digoxin，DIG），其退火溫度為45～50 °C。同時為了增加ASE引物的反應特異性，可將SNP位點設計在ASE引物3'端的倒數(shù)第2位[11-13]。整個PCR-ASE擴增過程在Gene Touch（PCR）基因擴增儀（杭州博日科技有限公司）上進行。Nanodrop 2000微量分光光度計購自美國Thermo Fisher Scientific有限公司。PCR-ASE產物檢測所需的核酸試紙條和全封閉式靶核酸擴增物檢測裝置均購自杭州優(yōu)思達生物技術有限公司。

表1 本研究所使用的引物、探針及相關序列

1.2 方法

1.2.1 血液中人基因組DNA的提取 對由杭州艾迪康醫(yī)學檢驗中心在2016年9—12月所采集的來自19名不同志愿者的全血樣本（1 mL），先采用蛋白酶K在56 ℃進行過夜消化處理；再采用酚氯仿抽提法提取人類基因組DNA。所提取的人類基因組DNA可先通過Nanodrop 2000微量分光光度計對其濃度進行測量，然后放置在-80 ℃進行長期保存。

1.2.2 PCR-ASE和檢測 PCR-ASE主要分為4個步驟：PCR擴增、ASE延伸、ASE延伸產物雜交和核酸試紙條檢測。（1）通過PCR外圍擴增引物對包含SNP位點的靶模板在較高退火溫度的條件下進行指數(shù)擴增（擴增步驟1），從而達到富集靶模板的目的；（2）在較低退火溫度的條件下，只有當ASE引物與SNP位點基因型一致時，才能在DNA聚合酶的作用下進行線性擴增（擴增步驟2），從而達到特異性檢測的目的；（3）ASE引物延伸所產生的單鏈產物可以與體系中的探針進行雜交，進而形成雙標記雜交產物；（4）形成的雙標記雜交產物可以通過核酸試紙條進行可視化檢測。見圖1。PCR-ASE的總反應體積為20 μL，成分分別為50 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris HCl（pH值7.6）、1% Triton X-100；dNTP（2 mmol/L）；Mg2+3 mmol/L；Taq DNA聚合酶 1 U；模板DNA 3 μL；外圍擴增引物的濃度為0.2 μmol/L，而ASE引物和探針的濃度均為 0.1 μmol/L。PCR-ASE程序為2個擴增步驟： 95 ℃ 5 min；然后在94 ℃ 30 s；66 ℃30 s的條件下運行40個循環(huán)（擴增步驟1）；接著在94 ℃ 30 s；50 ℃ 30 s的條件下運行5個循環(huán)（擴增步驟2）；最后在95 ℃放置5 min。所得的反應產物按照核酸試紙條或全封閉式靶核酸擴增物檢測裝置所提供的說明書進行檢測和判讀。如果核酸試紙條的質控線（生物素標記）和檢測線（抗FITC或抗DIG抗體）上同時出現(xiàn)紅色線條則為陽性；如果只有質控線上出現(xiàn)紅色線條則為陰性；如果質控線和檢測線上均無條帶出現(xiàn)則認為該次檢測無效。在PCR-ASE中，5'端FITC或DIG 標記的ASE探針會在DNA聚合酶的作用下進行延伸（擴增步驟2）。而延伸的單鏈產物會與3'端生物素標記的探針進行結合，形成同時包含生物素和FITC或DIG的雙標記產物。在檢測過程中，該雙標記產物會由于生物素與親和素之間的作用，先與試紙條加樣端上的親和素標記的紅色顆粒結合從而形成紅色顆粒-擴增產物-FITC或DIG復合物，并最終會由于FITC和抗FITC抗體或DIG和抗DIG抗體之間的相互作用而被固定在檢測線上，并使檢測線顯示出紅色條帶。而當無擴增產物形成時，親和素標記的紅色顆粒將移動至質控線，并與質控線上的生物素進行結合。

圖1 PCR-ASE的原理圖

1.2.3 多重PCR-ASE 在PCR-ASE中分別加入2種分別標記FITC和DIG的針對不同SNP基因型的ASE引物，然后按照1.2.2所述的條件進行反應。所得的擴增產物需用2條檢測線上分別標記了抗FITC抗體和抗DIG抗體的核酸試紙條進行檢測。在進行多重檢測時，所采用的核酸試紙條可不包含質控線。SNP基因型的檢測結果可根據(jù)不同檢測線上的抗體類型進行判讀。

1.2.4 基因測序和敏感性檢測 為了檢測PCRASE的反應敏感性，先通過Nanodrop 2000微量分光光度計對人類基因組DNA（純合子）濃度進行測量，然后對測量后的基因組DNA進行10倍系列的濃度梯度稀釋，稀釋得到的不同濃度梯度的樣本再分別通過含不同ASE引物的PCR-ASE進行檢測。同時，本研究基因測序方法被用來驗證PCR-ASE檢測結果的準確性。

2 結果

2.1 不同擴增步驟循環(huán)數(shù)對PCR-ASE的影響

由于PCR-ASE中包含2個擴增過程，而2個擴增過程的目的存在很大的區(qū)別。因此，為了驗證2個擴增步驟中循環(huán)數(shù)的不同對結果的影響，本研究對2個擴增步驟中的循環(huán)數(shù)進行了相應的分配，然后用不同ASE引物（A型和G型）對同一個純合子樣本（G型）進行檢測，見圖2。圖2中擴增步驟1的循環(huán)數(shù)從20逐步增加到45，而步驟2的循環(huán)數(shù)則從25逐步減少到0，而總的循環(huán)數(shù)一直保持在45。根據(jù)結果顯示，總體來說隨著擴增步驟2數(shù)量的減少，來自于A型ASE引物所導致的非特異性信號逐步減弱并最終消失。當擴增步驟2的循環(huán)數(shù)＞15時，A型ASE引物存在明顯的非特異性信號。而當擴增步驟2少于10個循環(huán)時，只有與模板基因型一致的G型ASE引物才出現(xiàn)陽性信號。但是當擴增步驟2為0個循環(huán)時，2種ASE引物的檢測結果均為陰性。

2.2 多重PCR-ASE檢測

圖2 PCR-ASE中2個不同擴增步驟數(shù)量對結果的影響

對多重PCR-ASE所得的擴增產物需用不同檢測線上分別標記了抗FITC抗體和抗DIG抗體的核酸試紙條進行檢測，檢測結果見圖3。圖3分別顯示了p53基因282位點3種不同基因型的檢測結果G/G、A/A、G/A。如果只有上面或者下面1條檢測線出現(xiàn)紅色條帶則分別代表該樣本為純合子G和純合子A，而2條檢測線上均出現(xiàn)條帶的樣本則為雜合子。見圖3。

2.3 PCR-ASE敏感性檢測和準確性的驗證

圖3 多重PCR-ASE和敏感性檢測結果

對已知濃度的純合子人類基因組DNA進行10倍系列的濃度梯度稀釋，然后通過相應的PCR-ASE對所得的樣本進行檢測，結果見圖3。隨著樣本濃度的降低，檢測線上的信號強度逐漸減弱，PCR-ASE的反應敏感性為88 ng/反應。而當ASE引物與模板基因型不完全配對時，該梯度稀釋的結果全部為陰性。

為了驗證PCR-ASE檢測結果的準確性，分別對19份臨床樣本的5個不同的SNP位點進行檢測，并將其檢測結果與基因測序法進行比較，符合率為100%。見圖3。

3 討論

SNP是第3代遺傳標記和目前生物學研究的熱點，隨著人類基因組學、藥物基因組學以及精準醫(yī)療的發(fā)展，如何快速地對其進行有效的檢測就顯得尤為迫切[14]。目前SNP的檢測技術主要有基因測序、PCR-限制性片段長度多態(tài)性、高效液相、基因芯片等[14]，但是這些方法相對來說操作比較復雜，技術要求高，儀器設備昂貴。這些特點在一定程度上限制了SNP檢測的應用，特別是在一些發(fā)展中國家中的使用。為了解決這一問題，我們開發(fā)了一種操作簡單和技術要求低的基于PCR-ASE的SNP檢測方法，其結果可通過核酸試紙條進行可視化檢測。

PCR-ASE原理分別結合了PCR快速有效擴增靶基因和AS-PCR能對SNP不同基因位點進行區(qū)分的優(yōu)點。PCR-ASE先通過PCR外圍擴增引物對包含SNP位點的靶模板在較高退火溫度的條件下進行指數(shù)擴增（擴增步驟1），從而達到富集靶模板的目的。而在此過程中，ASE引物由于其退火溫度較低而無法參與到擴增步驟1中。然后在較低退火溫度的條件下，在已擴增的靶模板基礎上，只有當ASE引物與SNP位點基因型一致時，其才能在DNA聚合酶的作用下進行線性擴增（擴增步驟2），從而達到特異性檢測的目的。在擴增步驟2中，由ASE引物延伸所產生的單鏈產物可以與體系中的探針進行雜交，進而形成雙標記雜交產物。而該雙標記雜交產物可以通過核酸試紙條進行可視化檢測。

為了驗證PCR-ASE中的擴增步驟1和擴增步驟2對檢測結果的影響，在維持總循環(huán)數(shù)不變的情況，逐步改變擴增步驟1和擴增步驟2 中的擴增循環(huán)數(shù)的分布。在擴增步驟1循環(huán)數(shù)較少的情況下會導致有大量的外圍擴增引物殘留，而殘留的外圍擴增引物就會參與到擴增步驟2中。根據(jù)以往的文獻，由于Taq DNA 聚合酶保真度的問題，在退火溫度較低的情況下，AS-PCR擴增過程存在一定的出錯概率[13]，因此非特異性ASE引物在與模板不完全互補的情況下也可以進行結合并延伸，進而產生非特異性模板。在步驟2循環(huán)數(shù)較多的情況下，該非特異性模板會在殘留的外圍擴增引物與非特異性ASE引物的共同作用下進行指數(shù)型擴增，最終導致假陽性的出現(xiàn)。但是隨著擴增步驟1循環(huán)數(shù)的增加，外圍擴增引物會被大量消耗。因此在進行擴增步驟2時，可有效避免外圍擴增引物對擴增步驟2的干擾，ASE引物只能進行單鏈延伸反應，只起到一個線性擴增的效應，而無法對非特異性信號進行有效的放大。同時隨著擴增步驟2循環(huán)數(shù)的減少，可進一步抑制非特異性信號。但是如果將擴增步驟2循環(huán)數(shù)降低為零時，由于ASE引物無法參與到擴增步驟1中，就會導致結果的假陰性。

為了降低PCR-ASE操作的復雜性，p53基因282位點3種不同基因型模板被用來對多重PCR-ASE的可行性進行驗證。當模板為雜合子時，2條檢測線均出現(xiàn)了紅色條帶；而當模板基因型為純合子時，只有1條檢測線出現(xiàn)信號。通過對已知濃度的人基因組DNA進行10倍系列的濃度梯度稀釋，然后利用PCR-ASE進行檢測，結果顯示PCR-ASE的敏感性為88 ng/反應。同時為了驗證PCR-ASE的準確性，分別對19份臨床樣本的5個不同的SNP位點進行基因檢測，其檢測結果與PCR-ASE結果完全一致。這些結果均證明了PCR-ASE是一種簡單、快速、結果準確可靠、適合于普通實驗室開展的SNP基因型檢測新方法。

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