俞達輝，吳道立，袁沖，褚文炎

（余姚市人民醫(yī)院心胸外科，浙江 余姚 315400）

肺癌是全球惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一，嚴重威脅著人類的健康和生命。肺腺癌是其最常見的組織學亞型[1]。隨著手術(shù)治療、放化療、靶向治療以及免疫治療等多種治療手段的應用和發(fā)展，肺腺癌患者的療效有所提高，但其5年總生存率仍然為4%～17%[2]。

腫瘤浸潤淋巴細胞 （tumor-infiltrating lymphocyte，TILs） 作為一類由不同細胞構(gòu)成的異質(zhì)細胞群，可浸入腫瘤組織直接反映宿主與腫瘤之間的免疫應答狀態(tài)[3]。CD45分子，即蛋白絡氨酸磷酸酶受體C型，可作為T淋巴細胞亞群的分類標志。CD45RO+記憶T細胞是較常見的T細胞亞型，有強大的自我更新能力，可在再次接觸抗原后產(chǎn)生強烈的免疫應答，從而在抗腫瘤免疫反應中起著重要作用[4]。然而，關(guān)于CD45RO表達水平在肺腺癌患者中的作用目前尚不明確。因此，本研究旨在評估腫瘤組織CD45RO表達水平與肺腺癌手術(shù)患者的臨床病理參數(shù)及預后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究為前瞻性隊列研究設計，連續(xù)納入了121例2009年3月至2012年2月于余姚市人民醫(yī)院心胸外科接受開胸手術(shù)治療的肺腺癌患者。納入標準為： （1） 所有患者均根據(jù)其臨床特征、影像學檢查和病理證實確診為肺腺癌； （2） 所有患者術(shù)前未進行任何新輔助治療 （包括新輔助化療、放療等），且均接受了肺部手術(shù)治療； （3） 所有患者年齡>18歲。排除標準： （1） 有嚴重感染、嚴重肝功能異?；驀乐啬I功能異常患者，合并其他惡性腫瘤的患者或有其他惡性腫瘤史的患者； （2） 預期生命值<12個月患者； （3）有認知障礙或其他因素導致預估難以執(zhí)行定期隨訪和評估的患者。本研究經(jīng)過余姚市人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署了知情同意書。手術(shù)中采集肺腺癌組織和癌旁組織標本，然后采用福爾馬林浸泡并石蠟封存以備后期使用。

1.2 臨床病理特征采集和隨訪

采集所有患者的基線期人口學、臨床和病理特征信息 （包括年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、遠端轉(zhuǎn)移、腫瘤大小和TNM分期） ，按照第6版AJCC腫瘤分期手冊進行TNM分期評估。所有患者手術(shù)后均接受輔助化療：長春瑞濱25 mg/m2d1和d8，順鉑75 mg/m2d1，q3w 治療3～4個療程。隨訪截止日期為2017年2月，中位隨訪期為44個月?；颊咝g(shù)后6個月每月隨訪1次；6個月到2年每3月隨訪1次；之后每6月隨訪1次。無病生存期 （disease free survival，DFS）和總體生存期 （overall survival，OS） 是根據(jù)患者疾病復發(fā)、死亡和/或最終隨訪時間計算的。

1.3 免疫組化

采用anti-CD45RO抗體 （Abcam） 對組織樣本進行免疫組織化學染色： （1） 對石蠟切片進行脫蠟；加入修復液Tris-EDTA （pH = 9.0） 進行抗原修復；加入3%的過氧化氫溶液進行內(nèi)源性過氧化物酶阻斷；將其浸入4%牛血清白蛋白進行非特異性內(nèi)源性抗原的阻斷。 （2） 加入anti-CD45RO抗體，同時將其置于4℃冰箱里孵育過夜；洗后，加入辣根過氧化物酶 （合）共軛anti-IgG （Abcam） 對其再次進行孵育，同時室溫靜置30 min。 （3） 清洗和DAB處理；加樣器加入蘇木精進行復染。 （4） 脫水，封片。

2位病理科醫(yī)師采用雙盲法分別利用光學顯微鏡對其陽性細胞進行觀察閱片。每張切片隨機觀察視野腫瘤細胞，計算100個細胞/視野染色陽性的細胞比，在高倍鏡視野下 （高通濾波器，400倍） 。陽性細胞所占比例評分標準為：0分 （0%） 、1分（>0%～25%） 、2分 （>25%～50%） 、3分 （>50%～75%） 和4分 （>75%～100%） 。CD45RO以胞質(zhì)出現(xiàn)淺黃色至棕褐色者為陽性，染色強度評分標準：基本不著色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。最后，計算染色強度分數(shù)和染色面積分數(shù)的乘積得到總表達評分，并進行分組：低 （0～3分） 、中 （4～6分） 、高 （> 6分） 。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)展示形式主要為±s和百分比表示。采用χ2檢驗比較肺腺癌組織和癌旁組織CD45RO表達水平差異；采用Pearson檢驗分析肺腺癌組織CD45RO水平與患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)；采用Kaplan-Meier （K-M） 曲線和Log-rank檢驗分析肺腺癌組織CD45RO表達與DFS及OS的關(guān)聯(lián)；采用單因素和多因素COX風險比回歸模型進行基線期因素對于DFS及OS的預測作用分析。P> 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基線期信息

本研究納入121例肺腺癌手術(shù)患者，其中男69例、女52例；平均年齡 （62.97±9.87） 歲；腫瘤大小≤5 cm 68例 （56.2%） 、>5 cm 53例 （43.8%） ；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者71例 （58.7%） 、陽性50例 （41.3%） ；遠端轉(zhuǎn)移陰性患者119例 （98.3%） 、陽性2例 （1.7%） 。見表1。

2.2 CD45RO在肺腺癌組織中高表達

表1 肺腺癌患者基線期信息Tab.1 Baseline characteristics in surgical patients with LAC

免疫組織化學染色顯示，CD45RO相對于癌旁組織在肺腺癌組織中高表達，見圖1，表2。肺腺癌組織和癌旁組織中高、中、低表達CD45RO在肺腺癌組織中的數(shù)量分別為82、68、30，然而其表達在癌旁組織中的數(shù)量分別為17、59、104；2組差異有統(tǒng)計學意義 （P< 0.001） ，見表2。

圖1 免疫組化顯示CD45RO在肺腺癌組織中高表達Fig.1 High CD45RO expression in tumor tissue samples

2.3 肺腺癌組織中CD45RO表達水平與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)

腫瘤組織CD45RO表達水平與腫瘤大小 （r=-0.198，P= 0.029） 、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 （r= -0.184，P= 0.043）均呈負相關(guān)。見表2。

2.4 肺腺癌組織中CD45RO表達水平與DFS及OS的關(guān)聯(lián)

采用K-M曲線和Log-rank檢驗分析肺腺癌組織CD45RO表達與DFS及OS的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示肺腺癌組織中的CD45RO表達水平越高，DFS （P< 0.001）和OS （P< 0.001） 越長，見圖2。

2.5 肺腺癌患者DFS和OS的預后因素分析

采用單因素COX風險回歸模型分析肺腺癌組織CD45RO表達水平以及臨床病理特征分別對于其手術(shù)患者DFS和OS影響，顯示腫瘤組織CD45RO表達量與患者較好的DFS顯著相關(guān) （P< 0.001） 。然而，低分化 （P= 0.046） 、淋巴轉(zhuǎn)移 （P< 0.001） 及TNM分級 （P= 0.003） 與患者較差的DFS顯著相關(guān)。進一步采用多因素COX回歸模型分析肺腺癌手術(shù)患者DFS的獨立預測因素，發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織CD45RO表達量（P< 0.001） 能獨立預測其患者良好的DFS，然而，低分化 （P= 0.017） 和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 （P= 0.004） 均能獨立預測肺腺癌手術(shù)患者不良的DFS。見表3。

表2 CD45RO表達水平和患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)Tab.2 Correlation of CD45RO expression with clinicopathological properties

圖2 CD45RO表達水平與DFS以及OS的Kaplan-Meier曲線分析Fig.2 Kaplan-Meier curve for Correlations of CD45RO expression with DFS and OS

表3 肺腺癌患者DFS預后因素分析Tab.3 Analysis of predictive factors for DFS in patients with LAC

單因素COX分析發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織CD45RO表達量與患者較好的OS （P< 0.001） 有關(guān)，而低分化（P= 0.003） 、淋巴轉(zhuǎn)移 （P< 0.001） 、遠端轉(zhuǎn)移 （P=0.029） 及TNM分級 （P= 0.001） 均與患者較差的OS有關(guān)。多因素COX分析結(jié)果顯示，肺腺癌組織CD45RO表達量 （P< 0.001） 能獨立預測其手術(shù)患者良好的OS，而低分化 （P= 0.001） 、淋巴轉(zhuǎn)移 （P< 0.001） 及遠端轉(zhuǎn)移 （P= 0.001） 均能獨立預測其手術(shù)患者較差的OS。其他臨床病理特征對OS的預測作用，見表4。

表4 肺腺癌患者OS預后因素分析Tab.4 Analysis of predictive factors for OS in patients with LAC

3 討論

多種TILs，包括T細胞、B細胞以及樹突細胞等，可通過特異性識別和清除機體腫瘤細胞，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程[5]。其中CD45RO+TILs被發(fā)現(xiàn)在胃癌以及喉癌中呈高表達水平[4，6]。本研究有相似的發(fā)現(xiàn)。這可能是因為腫瘤發(fā)生與炎癥反應密切相關(guān)，腫瘤微環(huán)境中存在大量的白細胞，從而在所有白細胞上均有表達，且也稱為白細胞共同抗原（leukocyte common antigen，LCA） 的CD45被更多的發(fā)現(xiàn)[7]。

CD45是一類結(jié)構(gòu)相似的跨膜蛋白組成的分子，由PRPRC基因編碼[8]。CD45RO記憶T細胞再次接觸到腫瘤細胞時，可快速發(fā)生強烈的免疫反應，繼而殺傷腫瘤細胞[7]。研究[9]表明，CD45RO通過激活白細胞介素2 （interleukin-2，IL-2） 、干擾素γ （interferon-γ，IFN-γ） 以及腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 來抵抗宮頸癌細胞的增殖和遷移，繼而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。同時，CD45RO+記憶T細胞減少高遷移率族蛋白B1 （high-mobility group box 1，HMGB1） 的生成，抑制晚期結(jié)腸癌患者腫瘤細胞增殖分化和遷徙[10]。此外，CD45RO+TILs的表達水平與腎細胞癌患者的低分化和TMN分級、乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小、結(jié)腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及血管侵襲均呈負相關(guān)[11-13]。本研究有相似的發(fā)現(xiàn)，這可能是由于CD45RO可調(diào)節(jié)多種效應細胞產(chǎn)生大量的細胞因子，發(fā)生強烈的免疫應答來殺傷腫瘤細胞從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[9-10]。

一些研究[14]評估了CD45RO與惡性腫瘤患者預后的關(guān)聯(lián)。乳腺癌患者中CD45RO高表達組的腫瘤復發(fā)率低于低表達組。且CD45RO高表達水平已被證實與腎細胞癌以及胃癌患者良好的DFS和OS均密切相關(guān)[12，15]。本研究有相似的發(fā)現(xiàn)。這可能是因為CD45RO能促進大量效應細胞因子的分泌，產(chǎn)生強烈的免疫應答，殺傷腫瘤細胞來抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，繼而影響患者的預后情況[9-10]。

本研究仍有有一些不足： （1） 主要納入了可接受肺腺癌手術(shù)的Ⅰ～Ⅲ期的患者 （Ⅳ期患者僅2例），因此CD45RO表達水平在肺腺癌Ⅳ期患者的預后作用尚不明確； （2） 對肺腺癌患者組織樣本CD45RO的表達量進行了鑒定，而未對血液中CD45RO表達量進行評估； （3） 樣本量相對較小。故進一步的研究需要擴大樣本容量并且同時納入肺腺癌Ⅳ期患者且采集患者血液樣本。

綜上所述，本研究表明，腫瘤組織中CD45RO表達水平可作為新穎且可靠的生物標志物，用于評估肺腺癌手術(shù)患者的臨床病理特征和預后情況。

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