李忠華，李慧峰，李曉蕾

（1. 貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，貴州 都勻 558000；2. 大慶油田總醫(yī)院病理科，黑龍江 大慶 163001；3. 貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，貴州 都勻 558000）

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是起源于神經(jīng)外胚層的顱內(nèi)常見(jiàn)腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的50%以上，具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高病死率和低治愈率的特點(diǎn)。雖然臨床上應(yīng)用手術(shù)、化療、放療等綜合治療方法，但是中低分化星形細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療效果仍無(wú)明顯改善，腫瘤多在術(shù)后7～10個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)[1]。因此，針對(duì)調(diào)控膠質(zhì)瘤增殖、分化的表面分子以及信號(hào)通路等新治療靶點(diǎn)的研究非常必要。瞬時(shí)感受器電位香草酸受體3 （transient receptor potential vanilloid 3，TRPV3） 是瞬時(shí)感受器電位通道蛋白的家族成員，被認(rèn)為是一種鈣離子通道蛋白，在皮膚、角化細(xì)胞、腦、脊髓、背根神經(jīng)節(jié)等多種組織中都有表達(dá)，并通過(guò)接受細(xì)胞外信號(hào)發(fā)揮其生理功能，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生影響[2-3]。在多種腫瘤中TRPV3都有表達(dá)，如結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、膀胱癌等，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。但是，TRPV3通道蛋白在膠質(zhì)瘤發(fā)展過(guò)程中的作用，仍未有相關(guān)研究和報(bào)道。本研究探討了TRPV3通道蛋白對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系增殖和侵襲的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

U251細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細(xì)胞庫(kù)。培養(yǎng)基DMEM購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，胎牛血清購(gòu)自四季青天杭生物科技有限公司。0.25%胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。MTT試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。TRPV3抗體購(gòu)自以色列Alomone公司。增殖細(xì)胞核抗原 （proliferating cell nuclear antigen，PCNA） 、基質(zhì)金屬蛋白酶2 （matrix metalloproteinase 2，MMP-2） 、基質(zhì)金屬蛋白酶9 （matrix metalloproteinase 9，MMP-9） 、細(xì)胞周期蛋白D1 （cyclin D1） 、鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ （calcium/calmodulin-dependent kinase Ⅱ，CaMKⅡ） 、磷酸化-鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ （phospho-calcium/calmodulindependent kinaseⅡ，p-CaMKⅡ） 抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。RIPA蛋白裂解液、BCA試劑盒、蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自碧云天公司。ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。TRPV3 siRNA （20 nmol/L，正義：5’-ACCUG CCUGAUGAAAGCUUTT-3’，反義：5’-AAGCUUUCA UAGGCAGGUTT-3’） 購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，X-tremeGENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Roche公司。

1.2 U251細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

37℃、5%CO2環(huán)境下，在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。分為空白對(duì)照組 （CON組） 、陰性對(duì)照組 （NC組） 、TRPV3 siRNA干擾組 （si-TRPV3組） 。細(xì)胞接種在6孔板中，培養(yǎng)至70%～80%融合后，按X-tremeGENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)分別將TRPV3 siRNA和NC siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.3 MTT法檢測(cè)TRPV3對(duì)U251細(xì)胞系增殖的影響

各組細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后以2000/孔接種到96孔板中，每孔總體積為100 μ L，每組細(xì)胞設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，共接種于5塊培養(yǎng)板中。在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h。按時(shí)間吸除培養(yǎng)液，每孔加入20 μ L無(wú)菌MTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，棄除孔內(nèi)上清，每孔加入二甲基亞砜150 μ L，震蕩15 min。應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度 （OD） 值。取6個(gè)復(fù)孔平均值，計(jì)算細(xì)胞的增殖率。

1.4 Western blotting

收集不同處理組的U251細(xì)胞，利用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA方法測(cè)定蛋白濃度，上樣量為60 μ g，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉2 h。滴加一抗工作液，4℃冰箱過(guò)夜，滴加二抗，室溫下孵育2 h，洗膜后進(jìn)行ECL顯色，應(yīng)用自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRPV3 siRNA轉(zhuǎn)染后U251細(xì)胞中TRPV3和PCNA蛋白表達(dá)減少

在U251細(xì)胞中敲除TRPV3表達(dá)，Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與CON組和NC組比較，siTRPV3組TRPV3蛋白表達(dá)明顯降低 （P< 0.01） ，CON組和NC組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與CON組和NC組比較，siTRPV3組U251細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)也減少 （P< 0.05） 。見(jiàn)圖1。

圖1 各組U251細(xì)胞中TRPV3和PCNA蛋白的表達(dá)Fig.1 TRPV3 and PCNA expression in U251 cells

2.2 敲除TRPV3表達(dá)后U251細(xì)胞增殖能力下降

MTT方法檢測(cè)各組U251細(xì)胞的增殖能力，si-TRPV3組與CON組和NC組比較，不同時(shí)間點(diǎn)U251細(xì)胞增殖能力均下降 （24和48 h，P< 0.05；72和96 h，P< 0.01） ，CON組和NC組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)圖2。

圖2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化Fig.2 Cell growth analyzed by MTT in U251 cells

2.3 敲除TRPV3表達(dá)后U251細(xì)胞侵襲能力下降

采用Western blotting檢測(cè)不同處理后U251細(xì)胞中侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的表達(dá)，與CON組和NC組比較，siTRPV3組MMP-2 （P< 0.01） 和MMP-9 （P< 0.05） 蛋白的表達(dá)明顯降低，CON組和NC組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)圖3。

圖3 各組U251細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)Fig.3 MMP-2 and MMP-9 expression in U251 cells

2.4 敲除TRPV3表達(dá)影響CaMKⅡ磷酸化和cyclin D1的表達(dá)

TRPV3是一種鈣離子通透性蛋白，Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，siTRPV3組U251細(xì)胞中p-CaMKⅡ表達(dá)明顯少于CON組和NC組 （P< 0.01） ，見(jiàn)圖4A；同時(shí)，cyclin D1的表達(dá)也明顯減少 （P< 0.01） ，見(jiàn)圖4B；CON組和NC組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖4 各組U251細(xì)胞中p-CAMKⅡ和 cyclinD1蛋白的表達(dá)Fig.4 p-CAMKⅡand cyclin D1 expression in U251 cells

3 討論

細(xì)胞內(nèi)鈣離子 （intracellular free Ca2+，[Ca2+]i） 是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，在多種生理、病理過(guò)程發(fā)揮作用，如調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡、壞死等。研究[5]已證實(shí)膠質(zhì)瘤的[Ca2+]i濃度高于正常細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的紊亂起了非常重要的作用。

TRPV3通道對(duì)Ca2+與Na+離子選擇是10∶1，研究結(jié)果表明，TRPV3可作為一種鈣離子通道蛋白。其通道開(kāi)放使[Ca2+]i濃度升高，引起膜去極化，動(dòng)作電位形成，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制被激活，進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)傳遞、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞生理功能[6-9]。研究[10]發(fā)現(xiàn)，TRPV3能夠促進(jìn)口腔上皮細(xì)胞的增殖和傷口愈合。因?yàn)槠潆妼?dǎo)較小，可以傳遞長(zhǎng)時(shí)程的鈣信號(hào)，而長(zhǎng)時(shí)程的Ca2+內(nèi)流影響細(xì)胞增殖等一些慢細(xì)胞的活動(dòng)。在膀胱癌的研究中發(fā)現(xiàn)，TRPV3基因激活后可明顯減慢膀胱癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡[11-12]。在非小細(xì)胞肺癌研究中發(fā)現(xiàn)，敲除TRPV3表達(dá)，腫瘤細(xì)胞增殖能力下降[4]。本研究結(jié)果顯示，在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中干擾TRPV3表達(dá)后PCNA表達(dá)減少，腫瘤細(xì)胞的增殖能力明顯下降；同時(shí)侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá)也減少，提示TRPV3能促進(jìn)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖和侵襲能力。

高濃度的Ca2+可通過(guò)激活磷脂酶C、蛋白激酶C、Ras/PI3K、ERK1/2等信號(hào)通路，通過(guò)多個(gè)環(huán)節(jié)參與細(xì)胞周期進(jìn)程調(diào)控，影響腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[13]。CaMKⅡ也受細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度調(diào)節(jié)，可以綁定在Ca2+/CaM被激活而發(fā)生自動(dòng)磷酸化，在結(jié)腸癌、卵巢癌等多種腫瘤中CaMKⅡ都被激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[14]。本研究結(jié)果顯示，U251細(xì)胞系中敲除TRPV3，p-CaMKⅡ表達(dá)減少，提示TRPV3影響了U251細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，進(jìn)而影響CaMKⅡ的激活。

目前研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子在多個(gè)環(huán)節(jié)參與細(xì)胞周期調(diào)控，可影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如cyclin D1，啟動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程。cyclin D1在許多癌組織中過(guò)表達(dá)，且與癌細(xì)胞的增殖有關(guān)，可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期G1期限制點(diǎn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，U251細(xì)胞系中敲除TRPV3，cyclin D1蛋白表達(dá)減少，提示TRPV3蛋白通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，調(diào)控細(xì)胞周期蛋白cyclin D1的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞周期進(jìn)程。

綜上所述，TRPV3通道蛋白能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖和侵襲能力。其機(jī)制可能是TRPV3通道開(kāi)放，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，cyclin D1過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的增殖。說(shuō)明TRPV3通道蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，為腫瘤靶向治療提供了新途徑，但是在不同腫瘤組織中TRPV3發(fā)揮的作用與機(jī)制還需要進(jìn)一步探討和研究。

[1]HAN S，LI Z，MASTER LM，et al. Exogenous IGFBP-2 promotes proliferation，invasion，and chemoresistance to temozolomide in glioma cells via the integrin β 1-ERK pathway [J]. Br J Cancer，2014，111 （7） ：1400-1409. DOI：10.1038/bjc.2014.435.

[2]李忠華，李曉蕾. 瞬時(shí)受體電位香草酸受體3的功能及其激活因素研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥，2016，56 （47） ：100-103. DOI：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.032.

[3]LO IC，CHAN HC，QI Z，et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells [J]. J Cell Physiol，2016，231 （2） ：403-413. DOI：10.1002/jcp.25086.

[4]LI XL，ZHANG QH，F(xiàn)AN K，et al. Overexpression of TRPV3 correlates with tumor progression in non-small cell lung cancer [J]. Int J Mol Sci，2016，17 （4） ：473. DOI：10.3390/ijms17040437.

[5]ZHANG X，ZHANG L，LIN B，et al. Phospholipid phosphatase 4 promotes proliferation and tumorigenesis，and activates Ca2+-permeable cationic channel in lung carcinoma cells [J]. Mol Cancer，2017，16 （1） ：147. DOI：10.1186/s12943-017-0717-5.

[6]HUANG SM，LEE H，CHUNG MK，et al. Overexpressed transient receptor potential vanilloid 3 ion channels in skin keratinocytes modulate pain sensitivity via prostaglandin E2 [J]. J Neurosci，2008，28 （51） ：13727-13737. DOI：10.1523/JNEUROSCI.5741-07.2008.

[7]KIM HO，CHO YS，PARK SY，et al. Increased activity of TRPV3 in keratinocytes in hypertrophic burn scars with postburn pruritus[J]. Wound Repair Regen，2016，24 （5） ：841-850. DOI：10.1111/wrr.12469.

[8]BROAD LM，MOGG AJ，EBERLE E，et al. TRPV3 in drug development [J]. Pharmaceuticals （Basel） ，2016，9 （3） ：1-17. DOI：10.3390/ph9030055.

[9]MORGAN PJ，HUBNER R，ROLFS A，et al. Spontaneous calcium transients in human neural progenitor cells mediated by transient receptor potential channels [J]. Stem Cells Dev，2013，22 （18） ：2477-2486. DOI：10.1089/scd.2013.0061.

[10]AIJIMA R，WANG B，TAKAO T，et al. The thermosensitive TRPV3 channel contributes to rapid wound healing in oral epithelia [J].FASEB J，2014，29 （1） ：1-11. DOI：10.1096/fj.14-251314.

[11]盧彥欣，岳續(xù)朋，蔡樹(shù)春，等. TRPV3在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖遷移能力的影響[J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，37 （5） ：508-511. DOI：1000-2715 （2014） 05-0508-04.

[12]赫俊會(huì)，張圣紅. 瞬時(shí)感受器電位香草酸受體3離子通道蛋白在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖遷移能力的影響[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2016，33 （10） ：2365-2368. DOI：10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2016.10.035.

[13]FECHER LA，AMARAVADI RK，F(xiàn)LAHERTY KT. The MAPK pathway in melanoma [J]. Curr Opin Oncol，2008，20 （2） ：183-189.DOI：10.1097/CCO.0b013e3282f5271c.

[14]RUSCIANO MR，SALZANO M，MONACO S，et al. The Ca2+/calmodulin-dependent kinaseⅡ is activated in papillary thyroid carcinoma （PTC） and mediates cell proliferation stimulated by RET/PTC [J].Endocr Relat Cancer，2010，17 （1） ：113-123. DOI：10.1677/ERC-09-0214.

[15]KHABAZ MN，ABDELRAHMAN AS，BUTT NS，et al. Cyclin D1 is significantly associated with stage of tumor and predicts poor survival in endometrial carcinoma patients [J]. Ann Diagn Pathol，2017，30：47-51. DOI：10.1016/j.anndiagpath.2017.04.006.