金歡煥 陳少云

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310053）

糖苷酶（Glycoside hydrolases, GH, EC 3.2.1）,又稱(chēng)糖苷水解酶，廣泛存在于生物體中,在自然界糖苷鍵的水解過(guò)程中扮演著非常重要的角色。糖苷酶作為一類(lèi)重要的化合物，在食品、醫(yī)療、工業(yè)等領(lǐng)域都有著十分廣泛的利用價(jià)值。但目前已知存在的糖苷酶大多數(shù)都存在酶活力低的問(wèn)題，且該酶來(lái)源十分匱乏。因此，尋找天然產(chǎn)耐有機(jī)溶劑糖苷酶的微生物顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)采用含有機(jī)溶劑的培養(yǎng)基，篩選能產(chǎn)耐有機(jī)溶劑糖苷酶的微生物，并對(duì)所得微生物進(jìn)行生物學(xué)鑒定，優(yōu)化產(chǎn)酶條件，為進(jìn)一步的研究和應(yīng)用提供酶源和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要設(shè)備與材料

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)希格瑪離心機(jī)有限公司，singma3K15型；PCR自動(dòng)系列化分析儀，德國(guó)耶拿分析儀，Tpersonal型；瓊脂糖水平電泳儀，北京市六一儀器廠,DYCP-32A型。

浙江臺(tái)州路橋某家化工企業(yè)所排污水長(zhǎng)期污染過(guò)的土樣。羧甲基纖維素鈉（CM C-N a）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、對(duì)硝基苯酚-p-D-葡萄糖苷、HEPES。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）10.0 g/L，DMF 5%，胰蛋白胨25.0 g/L，酵母提取物3.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，KHPO3.0 g/L，KHPO1.0 g/L，微量元素液100 mL/L（MgSO·7HO 0.3g，F(xiàn)eSO·7HO 0.005 g，CaCl0.005g，溶于100 ml蒸餾水中），pH 7.0。

初篩培養(yǎng)基：將富集培養(yǎng)基中的胰蛋白胨替換成(NH)SO5.0 g/L。

圖1 產(chǎn)耐有機(jī)溶劑糖苷酶微生物顯微形態(tài)

圖2 菌株ZXS的16SrDNA序列比對(duì)

圖3 不同因素對(duì)酶活力的影響

復(fù)篩液體培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（CM C-Na）10.0 g/L，蛋白胨 3.0 g/L，酵母提取物2.0 g/L，DMF 5%，(NH)SO5.0 g/L，NaCl 5 g/L，KHPO3 g/L，KHPO1.0 g/L，微量元素溶液100 mL/L，pH 7.0。1.2 方法

1.2.1 富集培養(yǎng)

將采集的土壤懸浮在裝有90 mL已滅菌的生理鹽水的錐形瓶中，在180 r/min，30 ℃條件下的搖床中震蕩30 min，取部分菌液轉(zhuǎn)移到富集液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，然后重復(fù)轉(zhuǎn)接2次。

1.2.2 初篩

選擇有明顯的微生物生長(zhǎng)的富集培養(yǎng)液，取部分富集培養(yǎng)液涂布于初篩固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察平板上微生物生長(zhǎng)情況。

1.2.3 復(fù)篩及酶活測(cè)定

從初篩培養(yǎng)基中挑取明顯生長(zhǎng)的單菌落于復(fù)篩液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后取菌懸液離心收集菌體，再用等體積的50 mM HPPES（pH7.0）緩沖液重懸，制得菌懸液，以對(duì)硝基苯酚葡萄糖苷為底物，測(cè)其糖苷酶活力大小。

1.2.4 菌種鑒定

分離純化菌種，觀察純種菌種的菌落形態(tài)，包括菌落大小，顏色，濕度，邊緣等；用革蘭氏染色，用顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)；根據(jù)試劑盒提取基因組DN A，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增（50 μl的體系：去離子水21 μl，PrimeSTAR MAX Premix 25 μl，基因組1 μl，引物pF-rRNA和pR-rRNA各1.5 μ l），瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。接著對(duì)PCR產(chǎn)物割膠回收，利用割膠回收試劑盒純化基因組以及回收基因組。最后，進(jìn)行測(cè)序，在基因庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，制作進(jìn)化樹(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 微生物鑒定

2.1.1 形態(tài)鑒定

對(duì)微生物進(jìn)行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察其染色情況以及形態(tài)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，微生物革蘭氏染色呈紫色，所以該微生物屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，并且微生物的形態(tài)呈桿狀，桿狀比較短，屬于短桿菌類(lèi)。

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)提取基因組，再進(jìn)行PCR，瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行割膠回收純化基因，并將片段收回用于測(cè)序。經(jīng)過(guò)序列比對(duì)，得出該微生物的生長(zhǎng)進(jìn)化樹(shù)如圖2所示。經(jīng)過(guò)序列比對(duì)得出該微生物與Enterobacter cloacae（陰溝腸桿菌）一類(lèi)序列最為接近。

2.2 微生物產(chǎn)酶性質(zhì)研究

2.2.1 反應(yīng)溫度對(duì)酶活力的影響

對(duì)于反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化，分別考察了20、25、30、35、37、40 ℃條件下微生物ZXS的產(chǎn)酶活力，每個(gè)條件都進(jìn)行3次平行重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果如圖3(A)所示，隨著反應(yīng)溫度的不斷升高，該酶活力先升高達(dá)到最大值后再降低，其中在溫度為35 ℃時(shí)產(chǎn)酶效果最佳。

2.2.2 反應(yīng)體系pH值對(duì)酶活力的影響

對(duì)于反應(yīng)體系中的p H進(jìn)行優(yōu)化，分別在p H為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的條件下進(jìn)行考察，每個(gè)條件進(jìn)行3次平行重復(fù)試驗(yàn)，再檢測(cè)微生物ZXS的產(chǎn)酶活力。結(jié)果如圖3(B)所示，隨著pH的變化酶活力也在不斷地變化，總體趨勢(shì)是隨著pH的不斷增大，酶活力呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中pH為7.0和10.0時(shí)酶活力達(dá)到最高，接近相等，所以該菌株在一定程度上具有耐受堿性能力，并且在pH 5.0~10.0之間時(shí)，此酶的催化活力都相對(duì)較穩(wěn)定。

2.2.3 DMF濃度對(duì)酶活力的影響

對(duì)于反應(yīng)體系中有機(jī)溶劑試劑DMF的含量進(jìn)行考察，分別選取了不含DMF試劑，含5%、10%、15%、20%DMF的反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)條件進(jìn)行3次平行重復(fù)試驗(yàn)，再檢測(cè)微生物ZXS的產(chǎn)酶活力。結(jié)果如圖3(C)所示，隨著DMF濃度的升高，菌株的產(chǎn)酶性能逐漸減弱，但并沒(méi)有完全抑制酶活力，所以總體上D MF對(duì)該酶的酶活力有一定的抑制作用。

2.2.4 不同有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響

對(duì)于微生物ZXS的耐有機(jī)溶劑性能進(jìn)行考察，在反應(yīng)體系中分別含有10%的DMF、二甲基亞砜（DMSO）、無(wú)水乙醇的條件下進(jìn)行催化反應(yīng)，每個(gè)條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，再檢測(cè)微生物ZXS的產(chǎn)酶活力。結(jié)果如圖3(D)所示，該菌株在相同條件下對(duì)二甲基亞砜的耐受力更好，對(duì)無(wú)水乙醇的耐受力最差。

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)篩選得到1株產(chǎn)耐有機(jī)溶劑糖苷酶的微生物，命名為ZXS，屬于Enterobacter cloacae（陰溝腸桿菌）類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性菌株。該菌株在無(wú)有機(jī)溶劑的情況下酶活最高達(dá)到40.2U/L。經(jīng)進(jìn)一步對(duì)其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，菌株培養(yǎng)8h后，在反應(yīng)溫度為35℃，pH為7.0，DMF含量為5%時(shí)，酶活力最高達(dá)到25.9U/L。

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