王佳寧 陳少云

（浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院，浙江杭州 310053）

輔酶是一種可以把化學基團在酶與底物分子間相互轉(zhuǎn)移的有機小分子，在一些酶的催化過程中必不可少。由于輔酶價格昂貴，工業(yè)中常用輔酶再生的方法滿足酶促反應對輔酶的需求。在前期研究中，我們利用Pichia pastoris GS115的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶GpdPP和己糖激酶HK偶聯(lián)，構建了一個高效的輔酶NADPH再生體系（GpdPP-HK）。葡萄糖激酶(GK)，在哺乳動物的胰腺以及肝臟中普遍存在，可在ATP存在時將葡萄糖磷酸化，生成6-磷酸葡萄糖。本文通過構建含有葡萄糖激酶GK基因的工程菌，實現(xiàn)克隆表達，優(yōu)化表達條件，為與GpdPP偶聯(lián)的輔酶N A D P H再生體系貢獻新的酶源。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與材料

超凈工作臺、壓力蒸汽滅菌器、臺式高速冷凍離心機、恒溫培養(yǎng)振蕩器、PCR自動系列化分析儀、超聲波細胞破碎儀、電泳儀。

Escherichia coli BL21(DE3)，pCDFDuet-1，HEPES、IPTG、4×Protein SDS PAGE Loading Buffer、Protein Marker、輔酶、PrimeSTARMAX DNA Polymerase。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR

PCR條件：（1）預變性95 ℃ 2 min。（2）變性98 ℃ 10 S，退火55 ℃ 15 S，延伸72 ℃ 20 S，循環(huán)30次。（3）延伸72 ℃ 2 min。（4）16 ℃ 5 min。

引物序列如下：

F-G K B S:C G G A A T T C G A T G G A C G A G A T A T G GT TTG CG GG

R-G K B S:C C G C T C G A G T T A A C A A T T T T G A T GTT TCAG CCAT TCAT TTTT AG

1.2.2 誘導

在含抗生素的液體LB中加入1 %的種子液，培養(yǎng)至OD為0.6～0.8時停止培養(yǎng)，加入0.5 mM IPTG進行誘導培養(yǎng)。

1.2.3 菌體收集與細胞破碎

靜息細胞菌懸液的制備：取適量培養(yǎng)好的菌液，8000 rpm 4 ℃離心5min，除去上清，ddH2O潤洗2次，再用HEPES緩沖液重懸菌體。

細胞破碎液的制備：取2 mL上述菌液至5 mL離心管中，置于冰上，用超聲破碎儀破碎30次，破3 S，停7S，Ampl 25 %。

粗酶液的制備：將此細胞破碎液12000 rpm 4 ℃離心1min，取上清。

1.2.4 酶活力的測定

參考文獻[4]。

1.2.5 工程菌表達條件的優(yōu)化

圖1 重組質(zhì)粒pCDFDuet-GK圖譜

圖2 優(yōu)化表達條件蛋白電泳圖

（1）誘導溫度：將搖床溫度分別設置為16℃、20℃、30℃、37 ℃ ，在OD為0.6時，加入 0.6 mM IPTG，誘導12 h。（2）誘導時機：將搖床溫度設為16 ℃，控制OD為0.6、0.9、1.2、1.5時，加入0.6 mM IPTG，誘導12 h。（3）誘導強度：將搖床溫度設為16 ℃，OD為0.6，分別加入0.3 mM、0.6 mM、0.9 mM、1.2 mM IPTG，誘導12 h。（4）誘導時間：將搖床溫度設為16 ℃，OD為0.6，加入0.6 mM IPTG ，分別誘導8 h，12 h，16 h，20 h。

2 結(jié)果與分析

圖3 優(yōu)化表達條件對GK表達的影響

2.1 含重組質(zhì)粒pCDFDuet-GK的工程菌的構建

通過PCR，從Bacillus subtilis 168基因組擴增目的基因GK（NCBI登錄號：NC_000964.3），再經(jīng)過酶切、酶連、轉(zhuǎn)化構建重組質(zhì)粒pCDFDuet-GK，經(jīng)測序驗證質(zhì)粒無誤。利用重組質(zhì)粒pCDFDuet-GK，被轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細胞E. coli BL21（DE3）后，挑取單菌落進行菌落PCR驗證，得到PCR產(chǎn)物大小位于750與1000之間，這與基因序列966bp一致，說明工程菌構建成功。

2.2 葡萄糖激酶GK的表達優(yōu)化

經(jīng)過工程菌表達條件的優(yōu)化，通過分析電泳圖，對比各組泳道1和泳道2、3，空白細胞均沒有表達出目標蛋白。對比泳道2、3表明重組后的工程菌經(jīng)過誘導，表達出的蛋白質(zhì)在29 kDa - 44.3 kDa之間，與目標蛋白一致。而且各組泳道3沉淀中含有的包涵體均很少，說明大部分表達出的均是可溶蛋白。

經(jīng)過對工程菌表達條件的優(yōu)化，測量酶活得到最優(yōu)誘導溫度為16℃，最優(yōu)誘導時機為OD值為0.6，最優(yōu)誘導強度為0.6 mM IPTG，最優(yōu)誘導時間為12h，在此些表達條件下，酶活最高為6.6 U/L。

3 結(jié)語

本實驗成功構建重組質(zhì)粒E.coil BL 21(pCDFDuet-GK)，并優(yōu)化了工程菌的各個表達條件，16 ℃是最優(yōu)誘導溫度，OD值0.6是最優(yōu)誘導時機，0.6 mM IPTG是最優(yōu)誘導強度，12 h是最優(yōu)誘導時間，優(yōu)化后的酶活為6.6 U/L。

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