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        葡萄糖激酶的克隆表達*

        2018-07-07 02:05:32王佳寧陳少云
        海外文摘·藝術 2018年2期
        關鍵詞:優(yōu)化

        王佳寧 陳少云

        (浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院,浙江杭州 310053)

        輔酶是一種可以把化學基團在酶與底物分子間相互轉(zhuǎn)移的有機小分子,在一些酶的催化過程中必不可少。由于輔酶價格昂貴,工業(yè)中常用輔酶再生的方法滿足酶促反應對輔酶的需求。在前期研究中,我們利用Pichia pastoris GS115的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶GpdPP和己糖激酶HK偶聯(lián),構建了一個高效的輔酶NADPH再生體系(GpdPP-HK)。葡萄糖激酶(GK),在哺乳動物的胰腺以及肝臟中普遍存在,可在ATP存在時將葡萄糖磷酸化,生成6-磷酸葡萄糖。本文通過構建含有葡萄糖激酶GK基因的工程菌,實現(xiàn)克隆表達,優(yōu)化表達條件,為與GpdPP偶聯(lián)的輔酶N A D P H再生體系貢獻新的酶源。

        1 材料與方法

        1.1 主要儀器與材料

        超凈工作臺、壓力蒸汽滅菌器、臺式高速冷凍離心機、恒溫培養(yǎng)振蕩器、PCR自動系列化分析儀、超聲波細胞破碎儀、電泳儀。

        Escherichia coli BL21(DE3),pCDFDuet-1,HEPES、IPTG、4×Protein SDS PAGE Loading Buffer、Protein Marker、輔酶、PrimeSTARMAX DNA Polymerase。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 PCR

        PCR條件:(1)預變性95 ℃ 2 min。(2)變性98 ℃ 10 S,退火55 ℃ 15 S,延伸72 ℃ 20 S,循環(huán)30次。(3)延伸72 ℃ 2 min。(4)16 ℃ 5 min。

        引物序列如下:

        F-G K B S:C G G A A T T C G A T G G A C G A G A T A T G GT TTG CG GG

        R-G K B S:C C G C T C G A G T T A A C A A T T T T G A T GTT TCAG CCAT TCAT TTTT AG

        1.2.2 誘導

        在含抗生素的液體LB中加入1 %的種子液,培養(yǎng)至OD為0.6~0.8時停止培養(yǎng),加入0.5 mM IPTG進行誘導培養(yǎng)。

        1.2.3 菌體收集與細胞破碎

        靜息細胞菌懸液的制備:取適量培養(yǎng)好的菌液,8000 rpm 4 ℃離心5min,除去上清,ddH2O潤洗2次,再用HEPES緩沖液重懸菌體。

        細胞破碎液的制備:取2 mL上述菌液至5 mL離心管中,置于冰上,用超聲破碎儀破碎30次,破3 S,停7S,Ampl 25 %。

        粗酶液的制備:將此細胞破碎液12000 rpm 4 ℃離心1min,取上清。

        1.2.4 酶活力的測定

        參考文獻[4]。

        1.2.5 工程菌表達條件的優(yōu)化

        圖1 重組質(zhì)粒pCDFDuet-GK圖譜

        圖2 優(yōu)化表達條件蛋白電泳圖

        (1)誘導溫度:將搖床溫度分別設置為16℃、20℃、30℃、37 ℃ ,在OD為0.6時,加入 0.6 mM IPTG,誘導12 h。(2)誘導時機:將搖床溫度設為16 ℃,控制OD為0.6、0.9、1.2、1.5時,加入0.6 mM IPTG,誘導12 h。(3)誘導強度:將搖床溫度設為16 ℃,OD為0.6,分別加入0.3 mM、0.6 mM、0.9 mM、1.2 mM IPTG,誘導12 h。(4)誘導時間:將搖床溫度設為16 ℃,OD為0.6,加入0.6 mM IPTG ,分別誘導8 h,12 h,16 h,20 h。

        2 結(jié)果與分析

        圖3 優(yōu)化表達條件對GK表達的影響

        2.1 含重組質(zhì)粒pCDFDuet-GK的工程菌的構建

        通過PCR,從Bacillus subtilis 168基因組擴增目的基因GK(NCBI登錄號:NC_000964.3),再經(jīng)過酶切、酶連、轉(zhuǎn)化構建重組質(zhì)粒pCDFDuet-GK,經(jīng)測序驗證質(zhì)粒無誤。利用重組質(zhì)粒pCDFDuet-GK,被轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細胞E. coli BL21(DE3)后,挑取單菌落進行菌落PCR驗證,得到PCR產(chǎn)物大小位于750與1000之間,這與基因序列966bp一致,說明工程菌構建成功。

        2.2 葡萄糖激酶GK的表達優(yōu)化

        經(jīng)過工程菌表達條件的優(yōu)化,通過分析電泳圖,對比各組泳道1和泳道2、3,空白細胞均沒有表達出目標蛋白。對比泳道2、3表明重組后的工程菌經(jīng)過誘導,表達出的蛋白質(zhì)在29 kDa - 44.3 kDa之間,與目標蛋白一致。而且各組泳道3沉淀中含有的包涵體均很少,說明大部分表達出的均是可溶蛋白。

        經(jīng)過對工程菌表達條件的優(yōu)化,測量酶活得到最優(yōu)誘導溫度為16℃,最優(yōu)誘導時機為OD值為0.6,最優(yōu)誘導強度為0.6 mM IPTG,最優(yōu)誘導時間為12h,在此些表達條件下,酶活最高為6.6 U/L。

        3 結(jié)語

        本實驗成功構建重組質(zhì)粒E.coil BL 21(pCDFDuet-GK),并優(yōu)化了工程菌的各個表達條件,16 ℃是最優(yōu)誘導溫度,OD值0.6是最優(yōu)誘導時機,0.6 mM IPTG是最優(yōu)誘導強度,12 h是最優(yōu)誘導時間,優(yōu)化后的酶活為6.6 U/L。

        [1]林璐,李莎,朱宏陽,等.固定化細胞生物催化合成異麥芽酮糖[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2008,34(3):29-32.

        [2]李卉.輔酶I的聚乙二醇修飾[D].杭州:浙江大學,2005.

        [3]江金鵬,吳旭日,陳依軍.解決氧化還原酶反應體系中輔酶問題的策略及其應用[J].生物工程學報,2012,28(4):410-419.

        [4]鄭雅楠,陳少云,劉文洪,等.基于己糖激酶與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶共表達的輔酶NADPH高效再生[J].微生物學通報,2016,43(12):2619-2626.

        [5]Iynedjian P B,Gjinovci A,Renold A E.Stimulation by insulin of glucokinase gene transcription in liver of diabetic rats[J].Journal of Biological Chemistry,1988,263(2):740-744.

        [6]Wang H,Iynedjian P B.Modulation of glucose responsiveness of insulinoma β-cells by graded overexpression of glucokinase[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1997,94(9):4372-4377.

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