范永會(huì)，王星利，張永麗，柴藝文

0 引言

腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)指非外傷造成的腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血，屬于急性腦血管疾病的危重癥，具有較高的發(fā)病率和致殘率，對人類生命健康造成嚴(yán)重危害[1]。腦內(nèi)出血發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，至今尚未完全闡明，且無特異性治療藥物[2]。近年研究表明，腦出血后伴發(fā)腦水腫是造成患者死亡率高的主要原因，而腦水腫的形成與炎癥反應(yīng)具有密切聯(lián)系[3]。細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子1(Suppressors of cytokine signaling-1,SOCS-1)是由細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞信號傳導(dǎo)負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，最新研究發(fā)現(xiàn)，其是先天性免疫及獲得性免疫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與自身免疫疾病、炎癥疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。七葉皂苷鈉具有消炎、消腫脹、恢復(fù)血管通透性等藥理活性，臨床研究表明，其在腦出血治療中亦具有明顯效果[5]。因此，本研究通過七葉皂苷鈉給藥，觀察其對腦出血大鼠血腫周圍腦組織SOCS-1的表達(dá)及相關(guān)炎癥因子的影響，以期闡明其治療腦出血的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取2月齡雄性SD大鼠40只，SPF級，體重(280±20)g，購自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號：SCXK(豫) 2013-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 七葉皂苷鈉注射液：購自武漢普生制藥有限公司，規(guī)格：5 mg/支，批號：國藥準(zhǔn)字H20057826。TNF-α、IL-1β、IL-6雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；TRIZOL購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Premix Ex Taq?熒光定量檢測試劑盒，購自日本Takara公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；RIPA蛋白裂解液和BCA試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；兔抗鼠SOCS-1、NF-κB抗體、羊抗兔IgG二抗，購自美國Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 鼠腦定位儀，購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；分析天平，購自德國Sartorius公司；冷凍離心機(jī)，購自美國Beckman公司；全波長酶標(biāo)儀，購自美國Thermo公司；Mastercycler PCR儀，購自德國Eppendorf公司；7500型熒光定量PCR儀，購自美國ABI公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀，購自北京六一儀器公司；全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)，購自美國Bio-Rad公司。

1.4 動(dòng)物分組及造模 將48只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、七葉皂苷鈉(低、中、高劑量)組，共5組，每組8只。參照Rosenberg等[5]自體血注射法建立模型。10%水合氯醛以350 mg/kg腹腔注射，固定大鼠于立體定位儀，顱頂消毒，正中線切開皮膚約1.5 cm，暴露前囟。自體血采集：置大鼠尾端于溫水7 min，酒精消毒，于尾端2 mm外斷尾采集血液。參照大鼠腦立體定位圖譜定位，前囟前0.2 mm、矢狀縫右側(cè)3.5 mm、深度5 mm處，微量注射器緩慢注射50 μl新鮮自體血液，6 min注完，留針5 min再緩慢拔出，骨蠟封閉，縫合頭皮。假手術(shù)組僅在同一時(shí)間點(diǎn)插入微量注射器，注射相同體積的生理鹽水。

1.5 給藥 術(shù)后，將大鼠置于安靜、溫暖飼養(yǎng)環(huán)境中，各組大鼠于造模后6 h開始給藥。給藥方法：七葉皂苷鈉低劑量組、中劑量組、高劑量組分別腹腔注射2.5、5.0、10.0 mg/(kg·d)的七葉皂苷鈉(溶于2 ml生理鹽水中)；假手術(shù)組及模型組給予同體積生理鹽水腹腔注射；高劑量聯(lián)合SOCS-1腺病毒干預(yù)組在造模后6 h腹腔注射10.0 mg/(kg·d)七葉皂苷鈉的基礎(chǔ)上，采用微量注射器向右側(cè)腦室注入含有SOCS-1基因的腺病毒10 μl，注射后留針5 min再緩慢拔出，骨蠟封閉，縫合頭皮，每天1次，給藥5 d。

1.6 觀察指標(biāo) ①神經(jīng)功能行為學(xué)評分[6]：采用Longa評分法對大鼠麻醉蘇醒后6 h、1 d、3 d、5 d進(jìn)行神經(jīng)行為評分。0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：大鼠倒懸時(shí)，前肢呈屈曲狀態(tài)，不能伸展前爪；2分：行走困難，有側(cè)旋轉(zhuǎn)征象；3分：行走困難并向病灶對側(cè)傾倒；4分：意識(shí)下降，難以行走。②腦組織含水量測量：給藥5 d后，將各組大鼠斷頭處死，采集大鼠腦組織稱重即為濕重，置于80 ℃烘箱中24 h烘干后稱重即為干重，組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。③ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平：給藥5 d后，腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)進(jìn)行麻醉后，在近心端抽取股靜脈血2 ml，室溫靜置10 min，3 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行分裝后存放于-80 ℃冰箱中；采用ELISA法檢測各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。④RT-PCR法檢測腦組織SOCS-1、NF-κB mRNA水平：大鼠麻醉取血后，斷頭取腦，并迅速剪取出血灶周圍腦組織，稱重后，迅速加入液氮進(jìn)行研磨，采用Trizol法提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR法檢測腦組織SOCS-1、NF-κB mRNA表達(dá)量。最終結(jié)果以β-actin作為內(nèi)參，采用2ΔΔCt法計(jì)算SOCS-1、NF-κB mRNA相對表達(dá)量，每組重復(fù)3次。引物序列見表1。⑤Western blot法檢測腦組織SOCS-1、NF-κB蛋白水平：樣本采集方法同上，稱重后剪碎，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解，提取總蛋白。采用BCA檢測試劑盒檢測蛋白濃度，調(diào)整濃度一致后，上樣20 μl通過10%SDS-PAGE分離膠分離蛋白，采用電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的脫脂乳室溫封閉1 h，吸棄封閉液，加入預(yù)先稀釋好的一抗，4 ℃孵育過夜，采用TBST洗滌膜，5 min×3次，加入羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌膜，5 min×3次，進(jìn)行ECL顯色，采用全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖片，并通過Image-J軟件進(jìn)行條帶灰度分析，最終結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的光密度比值表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

表1 基因的引物序列及產(chǎn)物大小

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評分比較 造模6 h后，假手術(shù)組大鼠未見明顯神經(jīng)行為變化，其他各組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)缺損癥狀，說明造模成功；造模1 d后各組大鼠神經(jīng)缺損最為嚴(yán)重，3、5 d時(shí)逐漸減輕，七葉皂苷鈉低、中、高劑量組大鼠在造模后1、3、5 d神經(jīng)行為評分均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且具有劑量依賴性。見表2。

2.2 各組大鼠腦組織含水量比較 給藥5 d后，假手術(shù)組、模型組及七葉皂苷鈉低、中、高劑量組大鼠腦組織含水量分別為78.23±0.52、81.36±0.69、80.72±0.57、80.03±0.48、79.26±0.51，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=38.526，P<0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織含水量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，七葉皂苷鈉低、中、高劑量組腦組織含水量均明顯降低，且呈一定劑量依賴性，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 七葉皂苷鈉對腦出血大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，七葉皂苷鈉低、中、高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯降低，且呈一定劑量依賴性，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.4 七葉皂苷鈉對腦出血大鼠腦組織SOCS-1、NF-κB mRNA表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SOCS-1和NF-κB mRNA水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，七葉皂苷鈉低、中、高劑量組大鼠腦組織SOCS-1 mRNA水平明顯升高，NF-κB mRNA水平明顯下降，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且均呈一定劑量依賴性。見圖1。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能行為評分比較(分)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較(ng/ml)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

圖1 各組大鼠腦組織SOCS-1、NF-κB mRNA表達(dá)水平

2.5 七葉皂苷鈉對腦出血大鼠SOCS-1、NF-κB蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SOCS-1、NF-κB蛋白表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，七葉皂苷鈉低、中、高劑量組大鼠腦組織SOCS-1蛋白表達(dá)量明顯升高，NF-κB蛋白表達(dá)量明顯降低，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且均呈一定劑量依賴性。見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織SOCS-1、NF-κB 蛋白表達(dá)水平

2.6 SOCS-1、NF-κB蛋白表達(dá)水平相關(guān)分析 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，腦出血大鼠腦組織SOCS-1和NF-κB的蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.704，P<0.05)。見圖3。

3 討論

近年來，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，腦出血的發(fā)病年齡逐漸趨于年輕化，且由于腦出血后多繼發(fā)腦組織病理改變，甚至造成腦細(xì)胞不可逆損傷，導(dǎo)致其致殘率較高，對患者及家庭均造成較大負(fù)擔(dān)[7]。腦出血后腦水腫多伴有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，該炎癥反應(yīng)是由白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞、補(bǔ)體等參與的炎性介質(zhì)釋放、炎性細(xì)胞遷移、腦組織破壞等過程，腦出血后炎癥細(xì)胞聚集于病灶，釋放炎性介質(zhì)，參與腦出血的病理生理過程[8]。研究表明，腦出血后炎癥因子的上調(diào)主要以TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等為主，TNF-α為促炎性細(xì)胞因子，可參與影響血管舒縮、導(dǎo)致炎性細(xì)胞自血管至神經(jīng)組織發(fā)生遷移，從而參與調(diào)節(jié)血腫周圍組織缺血性過程[9]；IL-1β亦為促炎性細(xì)胞因子，有研究顯示，其表達(dá)上調(diào)可破壞血腦屏障，導(dǎo)致出血后損傷加劇[10]；IL-6主要通過調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞來調(diào)節(jié)腦損傷過程。本研究采用自體血注射法建立模型，結(jié)果顯示，造模完成后大鼠均表現(xiàn)出不同程度的神經(jīng)功能損傷，說明造模成功，進(jìn)而對血清炎癥因子進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，腦出血大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高，表明腦出血所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)在腦細(xì)胞損傷及疾病進(jìn)展中可能發(fā)揮重要作用。

圖3 腦出血大鼠腦組織SOCS-1和NF-κB蛋白表達(dá)水平分布圖

七葉皂苷鈉屬于三萜皂苷鈉鹽，由婆羅子干燥成熟果實(shí)提取獲得，可通過抑制毛細(xì)血管通透性減輕水腫，同時(shí)還廣泛參與抗炎、抗腫瘤、改善血液循環(huán)、抗?jié)B出等過程。Zhang等[11]在針對糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合研究中發(fā)現(xiàn)，七葉皂苷鈉可通過抗炎和抗氧化作用有效控制和改善糖尿病大鼠的創(chuàng)面愈合；楊寧等[12]研究表明，七葉皂苷鈉能夠明顯抑制高血壓腦出血患者的炎癥反應(yīng)，改善腦水腫。本研究給予腦出血大鼠腹腔連續(xù)5 d給藥后，同樣觀察到大鼠神經(jīng)功能有所改善，血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6均明顯降低，與已報(bào)道觀點(diǎn)一致，且呈現(xiàn)明顯劑量依賴效應(yīng)，說明七葉皂苷鈉對腦出血誘發(fā)的炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

NF-κB是廣泛存在于真核細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子，在機(jī)體炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起核心作用，研究表明其能夠作用于炎癥機(jī)制、趨化因子、TNF-α、黏附分子等基因，進(jìn)而調(diào)控其轉(zhuǎn)錄翻譯[13]。近年來大量證據(jù)表明NF-κB與腦出血后繼發(fā)腦損傷具有密切聯(lián)系，其能夠促進(jìn)IL-1β、IL-6等炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而加劇炎癥反應(yīng)，加重腦水腫[14]。

SOCS-1是細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)控因子，能夠反饋?zhàn)钄嗉?xì)胞信號傳導(dǎo)，在白血病、銀屑病、惡性腫瘤等多種疾病中發(fā)揮重要作用，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)其能夠在某種程度上阻滯疾病進(jìn)展，因此被認(rèn)為是疾病靶向治療的候選基因[15-16]。最新研究發(fā)現(xiàn)，在腦出血大鼠模型中miR-155能夠通過下調(diào)SOCS-1的表達(dá)，促進(jìn)特異信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，增加TNF-α、IL-1β的轉(zhuǎn)錄，在腦出血誘導(dǎo)的炎癥中發(fā)揮重要作用[17]。Smith等[18]研究指出，SOCS-1不僅是JAK-STAT信號通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，亦是NF-κB、TLR等信號通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠水腫灶周圍腦組織的SOCS-1、NF-κB mRNA及蛋白水平均出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象，可能由于腦出血后腦組織缺血性損傷導(dǎo)致NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)加重，而在機(jī)體免疫系統(tǒng)調(diào)控下SOCS-1同樣出現(xiàn)升高，以發(fā)揮抑制作用，但SOCS-1含量雖有所增加，但與炎癥因子釋放量相比，其抑制活性仍處于較低水平，進(jìn)而使機(jī)體免疫調(diào)控失衡，致使繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生。本研究顯示，七葉皂苷鈉能夠明顯上調(diào)SOCS-1的表達(dá)，且隨著SOCS-1表達(dá)的增加，NF-κB表達(dá)出現(xiàn)明顯下降，兩者在腦組織中的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，與Smith等[18]的觀點(diǎn)一致。

綜上所述，七葉皂苷鈉能夠顯著減輕腦出血后腦水腫，改善腦神經(jīng)功能，其作用機(jī)制可能與上調(diào)SOCS-1的表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB及其相關(guān)炎癥TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)有關(guān)，本研究為臨床腦出血的防治提供了新的參考思路。

參考文獻(xiàn)：

[1] Kim JY,Bae HJ.Spontaneous intracerebral hemorrhage:management[J].J Stroke,2017,19(1):28-39.

[2] 李萍,趙樹明,胡亞男,等.腦出血發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].中華老年心腦血管病雜志,2015,17(2):214-215.

[3] Dong Y,Fan C,Hu W,et al.Melatonin attenuated early brain injury induced by subarachnoid hemorrhage via regulating NLRP3 inflammasome and apoptosis signaling[J].J Pineal Res,2016,60(3):253-262.

[4] Ye S,Lowther S,Stambas J.Inhibition of reactive oxygen species production ameliorates inflammation induced by influenza A viruses via upregulation of SOCS1 and SOCS3[J].J Virol,2015,89(5):2672-2683.

[5] 玄洪雷,榮陽,趙大明,等.依達(dá)拉奉聯(lián)合七葉皂苷鈉治療腦出血的療效分析與臨床研究[J].中國醫(yī)藥指南,2017,15(14):170-171.

[6] 牛彥彥,鮑春齡,岳亞琳,等.頭穴透刺對腦出血大鼠血腫周圍腦組織神經(jīng)生長因子表達(dá)的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2016,36(9):1107-1111.

[7] Zhong Z,Wang B,Dai M,et al.Carvacrol alleviates cerebral edema by modulating AQP4 expression after intracerebral hemorrhage in mice[J].Neurosci Lett,2013,555:24-29.

[8] Di NM,Behrouz R,Topel CH,et al.Hypoalbuminemia,systemic inflammatory response syndrome,and functional outcome in intracerebral hemorrhage[J].J Crit Care,2017,41:247-253.

[9] Welling LC,Welling MS,Teixeira MJ,et al.Intracerebral hemorrhage,vagus nerve stimulation,and anti-inflammatory response[J].World Neurosurg,2016,93:423-424.

[10]張隴平,韓小芳,李雅.高血壓腦出血患者血清中IL-1β和TNF-α的表達(dá)及其與腦水腫的關(guān)系[J].重慶醫(yī)學(xué),2016,45(5):682-684.

[11]Zhang Z,Cao G,Sha L,et al.The efficacy of sodium aescinate on cutaneous wound healing in diabetic rats[J].Inflammation,2015,38(5):1942-1948.

[12]楊寧.七葉皂苷鈉對高血壓腦出血術(shù)后腦組織水腫及血清S100β、hs-CRP、NO、ET-1水平的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2016,25(32):3572-3574.

[13]王大永,徐翔,孫立倩,等.亞低溫治療對腦出血大鼠TLR4/NF-κB介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)的影響[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2015,31(3):309-314.

[14]廖遠(yuǎn)生,吳成翰.核因子κB在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中作用的研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2016,14(11):1246-1248.

[15]Beldi-Ferchiou A,Skouri N,Ben AC,et al.Abnormal repression of SHP-1,SHP-2 and SOCS-1 transcription sustains the activation of the JAK/STAT3 pathway and the progression of the disease in multiple myeloma[J].PLoS One,2017,12(4):e0174835.

[16]孫玉鳴,徐春雷,黃勇,等.SOCS1對炎癥和輔助性T細(xì)胞作用的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究與教育,2017,34(3):68-72.

[17]Xu HF,Fang XY,Zhu SH,et al.Glucocorticoid treatment inhibits intracerebral hemorrhage-induced inflammation by targeting the microRNA-155/SOCS-1 signaling pathway[J].Mol Med Rep,2016,14(4):3798-3804.

[18]Smith CL,Dickinson P,Forster T,et al.Identification of a human neonatal immune-metabolic network associated with bacterial infection[J].Nat Commun,2014,5:4649.