穆峰 鄭修廣 劉圣恒 陳光偉 張作文 李紅梅 張運宏 牟曉洋

(重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院1.神經內科；2.檢驗科；3.神經外科，重慶 402260)

腦出血是危害人類健康的常見病﹑多發(fā)病，其致殘率和死亡率居高不下。而且存活的患者中，會有較多患者遺留永久殘疾，如偏癱。本課題擬通過外源性NGF聯(lián)合康復訓練作用于腦出血大鼠，觀察并了解NGF聯(lián)合康復訓練在腦出血致偏癱大鼠促其功能恢復的作用及其機制，為NGF聯(lián)合康復訓練在腦出血患者中的應用提供實驗證據和理論基礎，開拓新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及其分組 健康清潔級成年雄性SD大白鼠96只，體重(280±50)g(由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)。實驗動物隨機分為對照組、康復訓練組、NGF治療組(腹腔內注射神經生長因子30ug/kg)和康復訓練聯(lián)合NGF治療共四組，每組各24只。每組下設3個觀察時間點，分別為造模成功后第1﹑2﹑3周和每個觀察時間點8只大鼠。

1.2 方法 康復訓練組：造模成功后，進行平衡、 旋轉、抓握訓練。NGF組：每天腹腔內注射神經生長因子30ug/kg。NGF聯(lián)合康復訓練組：按照康復訓練組和NGF組方法進行。對照組：不予任何處理。

1.2.1 腦出血大鼠模型的制備 采用膠原酶誘導法建立大鼠腦出血動物模型[1]，具體步驟如下：大鼠術前12h禁食，4h禁水，用0.4%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔麻醉。保證手術操作期間大鼠有自主呼吸，俯臥固定于江灣型動物頭顱立體定位儀上。將大鼠頭皮丁字形切開，取前囟為原點，向右3mm，向后1mm，深度5mm為進針點。骨鉆鉆開顱骨，進針后緩慢注入含0.5U膠原酶的生理鹽水2uL，留針2min，緩慢退針，骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合皮膚。術中大鼠肛溫保持在36.5～37.50C ，手術后大鼠被送到通風和有空調的動物房飼養(yǎng)。

1.2.2 模型成功評價 根據Berderson等[2]的評定方法分為四級。0級：沒有神經功能缺失癥狀；1級：將大鼠尾巴提起時，可見癱瘓側前肢回收屈曲于腹下，正常側前肢向地面伸展；2級：除1級體征外，向癱瘓側推大鼠時阻力較對側明顯降低；3級：除1級、2級體征外，大鼠有向癱瘓側旋轉的行為。實驗動物大部分2h內蘇醒。注入膠原酶后2h以后對大鼠神經功能缺損癥狀進行評定，如果神經功能缺損癥狀達1、2、3級判斷為造模成功，否則排除進一步實驗。

1.2.3 康復訓練方法 康復訓練組及NGF聯(lián)合康復訓練組于造模后休息2d，從第3d起開始采用自制儀器進行康復訓練:①平衡木訓練采用170cm長、2cm寬的方木棒，平放在距地面7cm處，作為一個平衡木讓大鼠在上面行走，用于評估及訓練大鼠的平衡功能。②轉棒訓練采用長150cm、直徑4.5cm的木棒1根，其中點固定在3r/min的轉動器上，分別向左右交替轉動，用于評估及訓練大鼠的動態(tài)平衡功能。③網屏訓練，網屏為50cm*40cm網帶，1cm*1cm網眼，網板的左右和上方都用25cm高的木板框邊，網屏距地面高度為80cm，下方鋪以12cm厚的海綿。先將網屏水平放置，將老鼠放在上面，然后緩緩地將其一端抬高，在2s內將此網屏變成垂直位，保持5s，觀察大鼠是否會從網屏上掉下來或用前爪抓握住網屏，用于評價大鼠前爪抓握能力及肌力情況。以上訓練每天共計30min，每周康復訓練5d。

1.2.4 行為評估

1.2.4.1 神經功能障礙評分 按Garcia[3]等方進行神經功能障礙評分，最高分18分，最低分3分，分數(shù)越低，神經功能障礙越嚴重。

1.2.4.2 平衡木行走評分 評分標準分為6個等級。0分為大鼠能跳上平衡木，在上面行走時不會跌倒；1分為大鼠 能跳上平衡木，在上面行走時，跌倒概率低于50%；2分為大鼠能跳上平衡木，在上面行走時,跌倒概率高于50%；3分為大鼠在健側后肢輔助下能跳上平衡木，但受累的癱側后肢不能輔助向前移動；4分為大鼠在平衡木上不能行走，但可以坐在上面；5分為大鼠放在平衡木上會馬上掉下來。

1.2.4.3 轉棒行走評分 評分標準分為4個等級。0分為在轉動過程中，大鼠可在轉棒上行走；1分為在轉動過程中，60s以上時間，大鼠不會從轉棒上掉下來；2分為轉動開始后，大鼠從轉棒上掉下來；3分為轉動開始前，大鼠從轉棒上掉下來。

1.2.4.4 網屏實驗評分 評分標準分為4個等級。0分為大鼠前爪握住網屏超過5s，不會掉下來；1分為大鼠可暫時握住網屏，滑落一段距離，但不會掉下來：2分為大鼠在5s內掉下來；3分為網屏轉動時，大鼠立刻掉下來。

2 結果

2.1 各組大鼠術后2小時模型成功評價 在實驗過程中共有12只大鼠死亡，另有17只大鼠手術后模型評價為0級，被剔除實驗，用備用大鼠進行隨機補充。最后模型成功評價，見表1。

表1 各組大鼠術后2小時模型成功評價 Table 1 The evaluation of the model 2 hours after operation

注：0級為剔除的大鼠，未進入實驗

2.2 各組不同觀察時間點神經功能障礙評分 康復組及NGF組各觀察時間點神經功能障礙評分均高于對照組 (P<0.05)，且NGF+康復組各觀察時間點神經功能障礙評分均高于康復組及NGF組(P<0.05)。提示不管是康復訓練還是NGF治療均能改善ICH大鼠神經功能障礙，并且康復訓練聯(lián)合NGF治療對ICH大鼠神經功能障礙改善具有協(xié)同作用，見表2。

表2 各組不同觀察時間點神經功能障礙評分 Table 2 Neurological dysfunction score

注：與對照組比較，①P<0.05;與康復組比較，②P<0.05;與NGF組比較，③P<0.05

2.3 各組大鼠平衡木行走評分 各組大鼠不同觀察時間點平衡術行走評分，康復組及NGF組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；NGF+康復組與康復組及NGF組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組不同觀察時間點平衡木行走評分 Table 3 Balance wood walking score

注：與對照組比較，①P<0.05;與康復組比較，②P<0.05;與NGF組相比，③P<0.05

2.4 各組大鼠轉棒行走評分 各組大鼠不同觀察時間點轉棒行走評分，康復組及NGF組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；NGF+康復組與康復組及NGF組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 各組不同觀察時間點轉棒行走評分 Table 4 Stick walk score

注：與對照組比較，①P<0.05;與康復組比較，②P<0.05;與NGF組相比，③P<0.05

2.5 各組大鼠網屏實驗評分 各組大鼠不同觀察時間點網屏實驗評分，康復組及NGF組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；NGF+康復組與康復組及NGF組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表5。

表5 各組不同觀察時間點網屏實驗評分 Table 5 Screen test score

注：與對照組比較，①P<0.05;與康復組比較，②P<0.05;與NGF組相比，③P<0.05

3 討論

3.1 康復訓練與出血性腦損傷 康復訓練是對中樞神經系統(tǒng)最有效的刺激方式之一，所有運動都可向中樞神經系統(tǒng)提供各種反射性傳入，運動對大腦的功能重建和代償起著至關重要的作用。康復訓練對腦可塑性的影響與訓練的方式密切相關；并且與腦損傷后開始康復訓練的時間，以及運動量的大小密切相關[4]。出血性腦損傷后早期進行康復訓練能夠加快腦組織側支循環(huán)的建立，改善病灶區(qū)的血液供應，重塑腦功能。同時康復訓練有利于建立側支循環(huán)式神經軸突突觸間的聯(lián)系，和對側大腦半球功能代償及重組。通過反復的任務式特定訓練，促使?jié)撛诘纳窠浲泛屯挥|啟動，形成大腦反應突觸，在此基礎上神經周圍組織在突觸的作用下形成側支，使病灶處神經功能獲得重建[5-7]?？祻陀柧毜闹饕饔糜衃8]: ①它能加強中樞神經系統(tǒng)的緊張度，防止因長期臥床引起的全身生理機能退化。②它能改善偏癱肢體的血液循環(huán)，加強神經營養(yǎng)功能，從而預防或減輕肌肉、骨骼的廢用性萎縮。③它可使大腦處于休眠狀態(tài)的突觸活化，促進突觸發(fā)芽、再生，使得大腦的功能重組。因此，早期系統(tǒng)的康復訓練對腦出血后偏癱患者肢體運動功能的恢復有顯著促進作用，使患者的日常生活能力得到改善，從而提高患者的生存質量，降低致殘率，減輕家庭和社會負擔[9]。

3.2 NGF治療腦出血的作用機制 NGF是一種影響神經細胞存活及發(fā)育的多功能神經營養(yǎng)因子, 它在神經系統(tǒng)發(fā)育、正常功能的維持及損傷修復中起著十分重要的作用[10]。一方面，NGF能夠在機體內調節(jié)中樞神經系統(tǒng)基底前的腦膽堿能神經元發(fā)育、分化；另一方面，在出血性腦損傷的自我保護與修復中NGF也起著重要作用。 在出血性腦損傷中它主要通過以下幾個方面促進神經功能的恢復。①為神經功能的修復提供營養(yǎng)因子。NGF可以為損傷的神經元提供神經營養(yǎng)支持，加強正常神經活動所需要分子的表達，從而加快神經功能的修復[11]。Liu等[12]通過觀察幼齡、老齡大鼠腦內NGF水平,膽堿乙酰轉移酶( ChAT) 活性及相應的空間學習能力之間的相關性，發(fā)現(xiàn)3者同步發(fā)生年齡依賴性的變化。如在老齡大鼠側腦室內注入NGF，能顯著提高基底前腦膽堿能神經元內ChAT的活性,并促使其神經元體積增大。在Morris水迷宮實驗中,空間定位能力也明顯提升。②作用于神經干細胞。NGF可誘導神經干細胞向神經細胞分化并能夠促進其發(fā)育成熟，并為誘導分化后的神經細胞提供營養(yǎng)支持作用。出血性腦損傷后NGF可促進內源性NSCs增殖，保護受損神經元，促進神經纖維再生，誘導軸突發(fā)育,從而使受損的神經功能得到修復[13]。烏優(yōu)圖[14]等在觀察NSCs向神經元分化過程中神經生長因子對軸突生長的作用，結果顯示誘導組單個神經元的平均軸突數(shù)量和最長軸突平均長度均大于對照組。該實驗研究證明NGF可以促進NSCs向神經元分化，且對神經突起形成和生長均有明顯的促進作用。③對抗自由基。腦出血后，患者存在嚴重的炎性反應，NGF可以增加超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等自由基清除劑的活性，從而減輕神經元損傷[15]。 NGF可以通過增加過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等自由基清除劑的活性,減輕神經元損傷[16]。④抑制出血性腦損傷后的神經元凋亡。劉懷軍[17]等研究報道用犬腦內注入非肝素化的自體動脈血建立ICH動物模型，結果證實ICH早期血腫周邊組織中凋亡的神經細胞占37%。在出血性腦損傷中NGF通過抑制神經元凋亡的過程來實現(xiàn)神經保護的作用，尤其是在出血性腦損傷后引起的遲發(fā)性神經元凋亡中發(fā)揮重要的作用[18]。⑤促進新生血管的形成。腦出血的損傷部位存在血管破壞、出血及局部缺血，NGF對血管再生有一定的促進作用。研究發(fā)現(xiàn)NGF不僅可以通過調節(jié)血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達間接地促進新生血管形成，NGF還具有直接促進新生血管形成的作用[19-21]。

本實驗研究結果表明，康復訓練有利于建立側支循環(huán)式神經軸突突觸間的聯(lián)系，促使?jié)撛谏窠浲泛屯挥|啟動，形成大腦反應突觸。而神經生長因子則可以對抗自由基，減少神經元凋亡，以及促進血管新生等在出血性腦損傷的自我保護與修復中發(fā)揮重要作用。所以康復訓練聯(lián)合神經生長因子治療腦出血大鼠時具有協(xié)同作用。在實際的臨床工作中腦出血患者的神經功能重建是一項復雜而艱巨的工作，然而當前我國部分醫(yī)院還是按藥物治療為主體的治療模式，不重視康復訓練治療，導致腦出血患者致殘率高，生活質量降低。

4 結論

本實驗研究認為，神經康復訓練是降低腦出血患者致殘率的有效方法之一，臨床醫(yī)師應加強與神經康復醫(yī)師合作，建立起包括藥物治療、肢體功能康復、心理輔導等在內的卒中病房。使患者在接受臨床藥物治療的同時，能盡早接受康復指導和訓練，減少后遺癥，提高生活質量。

【參考文獻】

[1]Rosenberg GA,Mun-Bryee BS,Wesley M,etal.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats[J]. Stroke, 1990, 21(5):801-807.

[2]Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M,etal. Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke, 1986, 17(3): 472-476.

[3]Garcia JH, Wagner S, Liu KF,etal. Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats statistical validation [J].Stroke, 1995, 26(4): 627-635.

[4]楊敏、姜偉.運動訓練對大鼠腦可塑性影響的研究進展[J].中國康復醫(yī)學雜志，2006，21(10)：953-956.

[5]Hayden MS, Ghosh S. NF-κB in immunobiology[J]. Cell Res, 2011, 21(2):223-244.

[6]Mincheva S, Garcera A, Gou-Fabregas M,etal. The canonical nuclear factor-kappaB pathway regulates cell survival in a developmental model of spinal cord motoneurons[J]. J Neurosci， 2011, 31(17):6493-6503.

[7]Chen YL, Law PY, Loh HH. Sustained activation of phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/nuclear factor kappaB signaling mediates G protein-coupled delta-opioid receptor gene expression[J]. J Biol Chem, 2006, 10, 281(6):3067-3074.

[8]Yeo SS,Jang SH.Recovery of an injured corticospinal tract and an injured corticoreticular pathway in a patient with intracerebralhemorrhage[J].Neurol Rehabil,2013,32(2):305-309.

[9]林敏，鄒少娜.小量腦出血患者早期康復治療的臨床研究[J].重慶醫(yī)學，2014,4,43(12):1442-1444.

[10] 孫勇，侍堅，陸佩華，等．神經營養(yǎng)因子與神經干細胞[J]．生理科學進展，2002，33(4)：313-316．

[11] 賀丹，劉懷軍，汪國石，等．外源性神經生長因子在腦血腫灶周圍組織中的表達及對神經功能恢復的影響[J]．中國臨床康復，2004，8(31)：6894-6895．

[12] Liu W,Unick J,Galik E,etal.Barthel index of activities of daily living:item response theory analysis of ratings for longterm care residengts[J].Nurs Res,2015,64:88-99.

[13] FY Hsieh,HH Lin,SH Hsu. 3D bioprinting of neural stem cell-laden thermoresponsive biodegradable polyurethane hydrogel and potential in central nervous system repair[J].J Biomateriais，2015,71:48-57.

[14] 烏優(yōu)圖,王運杰.神經生長因子對神經干細胞分化及神經元軸突形成的影響[J].中國組織工程與臨床康復，2008，12(29)：5631-5635．

[15] R Levi-Montalcini,PU Angeletti. Essential role of the nerve growth factor in the survival and maintenance of dissociated sensory and sympathetic embryonic nerve cells in vitro[J].J Developmental Biology, 2014, 7(63):65.

[16] 項婕，潘小娟.鼠神經生長因子對急性腦出血患者腫瘤壞死因子-α、血清基質金屬蛋白酶-9和超氧化物歧化酶水平的影響[J].實用藥物與臨床,2014,17:412-415．

[17] 劉懷軍，賀丹．神經生長因子對腦出血血腫灶周神經元和神經膠質細胞的影響[J].中國急救醫(yī)學，2005，25(9)：651-653．

[18] 常煥顯，何曉英，莊建光，等．神經生長因子對大鼠腦血腫周圍細胞凋亡的影響[J]．藥學與臨床研究，2008，16(6)：440-443．

[19] 李強，伍亞民．神經生長因子與血管形成的研究進展[J]．國外醫(yī)學外科學分冊，2005，32(3)：220-223．

[20] Tanaka A,Wakita U,Kambe N,etal.An antocrine function of nerve growth Factor for cell cycle regulation of vascular endothelial cells[J].J Biochem Biophys Res Commum,2004,3(13):1009-1014.

[21] 花放，方秀斌．短暫性全腦缺血后再灌注大鼠紋皮質血管c-Fos蛋白表達及CGRP和NGF的影響[J]．解剖科學進展，2006，12(1)：15-17．