董涵 侯開領 周靜 袁明銘 夏介英 洪楊 張磊

(四川省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心，四川 成都 610041)

由于環(huán)境污染加重、人們工作和精神壓力增大等因素，人類不孕不育率顯著增加。研究表明每6對夫妻就有1對不育，其中由男方因素引起的約占50%[1]。大量研究表明，miRNAs在生物生長、發(fā)育、繁殖和凋亡等過程中起著重要的調控作用，miRNAs也調控著睪丸的正常發(fā)育和精子生成過程[2-3]。Lian等[4-5]發(fā)現(xiàn)miRNA-383在成熟停滯型男性不育(maturation arrest，MA)患者和非梗阻性無精癥(non-obstructive azoospermia, NOA)患者的睪丸樣品中明顯下調。目前國內外對miRNA-383研究報道相對較少，已有的研究主要集中在不育癥患者體內的表達情況和相關作用機制以及與腫瘤發(fā)生的關系[4-7]上。無直接在小鼠睪丸上轉染miRNA-383以觀察其對精子凋亡影響的，也沒有研究嘗試利用miRNA-383對健康動物的繁殖能力進行干預的。

本研究通過監(jiān)測轉染后雄鼠生活狀態(tài)，以及檢查部分器官病理變化和部分血液生化指標來觀察其對動物機體的影響，為建立完善的活體動物體內轉染技術平臺，繼而進一步利用miRNAs數據庫建立各種動物模型奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 試驗動物 SPF級KM小鼠64只雌雄各半，10 周齡，由四川省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心提供(生產許可證號:SCXK川 2013-19，使用許可證號:SYXK 川 2013-100)。若干只10 周齡SPF級KM小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，雌雄按照1:1比例隨機組成家庭，選取第一胎產子數為10只左右的32個家庭，隨機分成4組，分別標記為：①miRNA-383過表達組。②miRNA-383抑制組。③轉染對照組。④空白對照組，每組8個家庭。

1.1.2 主要試劑 Mum-mimic-miRNA-383、inhibitormiRNA-383，由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；EntransterTM- in vivo(動物體內RNA轉染試劑)，購自北京英格恩生物科技有限公司，批號18668-11-1；TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，購自 TaKaRa，批號9767-AK901；TaqManTMMicroRNA Assays Data Sheet、TaqMan?Universal Master Mix Ⅱ、TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit，均購自Applied Biosystems；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，購自BD；HEPES，購自SIGMA。孵育緩沖液：10mmol/L HEPES、140mmol/L NaCl、2.5mmol/L CaCl2、pH=7.4。

1.1.3 主要儀器 生物安全柜，購自AIRTECH，型號BSS-130011A2；離心機，Thermo，LEGEND MICRO 17R；熒光定量PCR儀，Applied Biosystems，Step One；流式細胞儀，beckman，F(xiàn)C500；電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，ML203/02；微量進樣器，上海安亭微量進樣器廠，MC10uL；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療，HH·BII·420-BS-Ⅱ；Venus鑷。

1.2 方法

1.2.1 睪丸轉染與觀察記錄 miRNA稀釋：將含有1OD Mum-mimic-miRNA-383和inhibitormiRNA-383干粉的EP管用10μlDEPC水稀釋，稀釋后miRNA濃度約為3.3μg/μl。各組KM小鼠家庭在雌鼠第一胎產子前雌雄分開，最后一只雌鼠產子后5d定義為第0d，然后分別在第1、4、7d對①～④組雄鼠進行睪丸轉染，每支睪丸注射轉染混合物10μl，不同組別轉染混合物構成(見表1)。第1d完成注射后12h再次將4組雄鼠與原配偶合籠，第10d將雄鼠取出用于采樣及后續(xù)步驟。期間每天對雄鼠進行觀察、稱重。雌鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，直至第二胎出生，記錄產子數后脫頸處死。

表1 不同組別轉染混合物構成情況 Table 1 Composition of transfected mixture in different groups

注：表內混合物劑量是每支睪丸用量；每組轉染混合物充分混合后室溫靜置15分鐘

1.2.2 實驗動物取樣與內臟病理切片檢測 解剖取心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、睪丸、附睪稱重，計算臟器指數。肝、腎、腎上腺和睪丸放入福爾馬林溶液中固定1周，常規(guī)石蠟包埋，切片備用，HE染色，光鏡觀察。

1.2.3 熒光定量檢測 每組隨機選兩只雄鼠用于熒光定量檢測，每只雄鼠取1支睪丸。用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒提取總RNA，然后利用TaqManTMMicroRNA Assays Data Sheet、TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan?Universal Master Mix Ⅱ完成對Mum-miRNA-383和內參基因U6的反轉錄和熒光定量。

1.2.4 精子凋亡率檢測 雙側附睪置于潔凈的培養(yǎng)皿內，事先放入孵育緩沖液。剪刀剪破附睪管并用Venus鑷擠出精子團，經四層擦鏡紙過濾去除雜質，獲得精子懸液。取1×106個精子細胞于試管中，1500rpm離心5分鐘，小心棄去液體，加4℃ PBS洗滌3次利用Annexin V-FITC/PI雙染色后，用流式細胞儀檢測精子凋亡情況。

1.2.5 血液生化指標檢測 雄鼠用摘眼球法取血，然后脫頸處死，血液1500rpm離心5分鐘，取血清檢測與肝功、腎功密切相關的ALTL(谷丙轉氨酶)、ASTL(谷草轉氨酶)、CREA(肌酐)、UREAL(尿素)以及UA2(尿酸)的含量。

2 結果

2.1 熒光定量結果 不論與空白對照組還是轉染對照組相比(定義空白對照組Mum-miRRNA-383表達量為1)，miRNA-383過表達組平均表達量極顯著升高(P<0.01)，miRNA-383抑制組顯著降低(P<0.01)，其中miRNA-383過表達組平均表達量是轉染對照組的16.89倍，而轉染對照組又是miRNA-383抑制組的15.75倍。而空白對照組和轉染對照組之間表達量差異不顯著(P>0.05)。說明各組睪丸成功轉染miRNA-383，其在miRNA-383過表達組中被高表達，在miRNA-383抑制組中被抑制表達，見圖1。

圖1 各組Mum-miRNA-383相對表達量 Figure 1 Relative expression of Mum miRNA 383 in each group注：與空白對照組比較，①P<0.05

2.2 睪丸轉染miRNA-383對雄性KM小鼠產子數的影響 各組在進行睪丸轉染后平均產子數都與轉染前有不同程度的下降，其中miRNA-383抑制組下降最多，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其余各組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miRNA-383過表達組下降最少，并與轉染對照組相比有增加趨勢，見表2。

表2 轉染前后各組產子數 Table 2 The number of output number before and after transfection

注：與空白對照組比較，①P<0.05

2.3 睪丸轉染miRNA-383對雄性KM小鼠精子凋亡的影響 流式細胞儀檢測精子凋亡。miRNA-383過表達組精子凋亡率平均數為(10.60±3.27)%，miRNA-383抑制組為(919.28±3.06)%，轉染對照組為(15.15±1.34)%，空白對照組為(7.20±0.71)%。從結果可以看出與空白對照組相比，miRNA-383過表達組、miRNA-383抑制組和轉染對照組精子凋亡率平均數均有增加的趨勢，其中miRNA-383過表達組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，miRNA-383抑制組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，轉染對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與轉染對照組相比，miRNA-383過表達組凋亡率下降且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，miRNA-383抑制組凋亡率增加差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明轉染試劑對精子有一定毒性，能增加精子凋亡率，但miRNA-383過表達能一定程度對抗該影響，起到抑制精子凋亡的作用，抑制miRNA-383的表達能加劇精子凋亡。

2.4 雄性KM小鼠生活狀態(tài)與體重變化情況 各組雄性小鼠無論在睪丸轉染前還是后均活潑好動、正常采食飲水和自由梳理毛發(fā)，主動與雌性相互聞嗅舔舐追逐，并且具有正常的交配行為。睪丸轉染期間雄性KM小鼠體重變化情況，每組平均體重均根據該組給藥前體重進行校正。從圖中可以看出各組在給藥后平均體重都出現(xiàn)一定程度的下降趨勢，其中miRNA-383過表達組校正后平均體重在給藥第4～9d與空白對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，第8d和9d與轉染對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余各組差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

2.5 內臟病理切片檢測結果 KM小鼠肝、腎、腎上腺和睪丸病理組織切片結果，見圖3。

圖2轉染期間雄性KM小鼠體重變化情況Figure2WeightchangesofmaleKMmiceduringtransfection

圖3 病理組織學HE染色顯示(400×) Figure 3 Histopathologoical HE stacining

注：圖①、②、③、④分別為miR383過表達組、miR383抑制組、轉染對照組和空白對照組肝臟組織切片圖，各組未見明顯異常；圖⑤、⑥、⑦、⑧分別為miR383過表達組、miR383抑制組、轉染對照組和空白對照組腎臟組織切片圖，miRNA-383過表達組和空白對照組未見明顯異常；miRNA-383抑制組和轉染對照組觀察到輕微腎間質血管周圍炎；圖⑨、⑩、、分別為miR383過表達組、miR383抑制組、轉染對照組和空白對照組腎上腺組織切片圖，miRNA-383過表達組腎上腺內細胞壞死伴炎細胞浸潤，其余各組未見明顯異常；圖、、、分別為miR383過表達組、miR383抑制組、轉染對照組和空白對照組睪丸組織切片圖，miRNA-383過表達組、miRNA-383抑制組和轉染對照組都發(fā)現(xiàn)一定程度的精曲小管急性壞死，間質內炎細胞浸潤、纖維組織增生；空白對照組未見明顯異常

2.6 小鼠血液生化指標 轉染對照組ALTL含量高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；miRNA-383過表達組和miRNA-383抑制組UA2含量均低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而miRNA-383過表達組和miRNA-383抑制組與轉染對照組相比各項指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.7 小鼠主要臟器指數 與空白對照組相比，miRNA-383過表達組腎上腺指數偏低且差異極顯著(P<0.01)；轉染對照組心臟指數偏高且差異顯著(P<0.05)。與轉染對照組相比，miRNA-383抑制組肺臟指數和腎臟指數差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其余指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明降低睪丸中miRNA-383表達量可能對小鼠肺臟和腎臟有一定影響，見表4。

表3 各組血液生化指標檢測結果 Table 3 Biochemical indexes of blood in each group

注：與空白對照組比較，①P<0.05

表4 內臟指數 Table 4 Visceral index

注：與空白對照組比較，①P<0.05;與轉染對照組比較，②P<0.05

3 討論

精子發(fā)生過程中，轉錄后調控非?；钴S，介導的調控機制在有序調控基因表達中扮演重要角色。對基因表達的精確時空調控是精子發(fā)生正常進行的根本條件，這種調控主要是發(fā)生在轉錄和表觀遺傳學水平上的[8]。所以對于繁殖相關microRNA調控機制的深入研究以及如何開發(fā)應用具有重要意義。Lian等[4-5]發(fā)現(xiàn)miRNA-383的上調和IRF1的下調與MA型男性不育患者的生精細胞有絲分裂活性相關，并且miR-383-IRF1-pRb通路與睪丸生殖細胞腫瘤細胞NT-2的存活關聯(lián)，總之miRNA-383抑制以IRF1為靶向的系列細胞周期相關基因。Huang等[9]發(fā)現(xiàn)正常男性miRNA-383主要表達于精原細胞和初級精母細胞，在精子中表達較少。miRNA-383能誘導γH2AX的下降，參與到DNA損傷通路的調控。而本試驗結果顯示與轉染對照組相比，增加雄鼠睪丸內miRNA-383表達量能顯著降低精子凋亡率，產子數有增加趨勢；抑制miRNA-383的表達量精子凋亡率則顯著增加，產子數有降低趨勢。該結果與Lian等[4,5]有同一性，但角度不同。這說明miRNA-383對雄鼠繁殖力起重要的正向調控作用，過表達miRNA-383能促進其繁殖力，而睪丸中缺乏miRNA-383能降低繁殖力。同時該結果還提示能夠通過睪丸轉染的方式，利用miRNAs對雄鼠繁殖力進行干預，為進一步制作不育動物模型或者不孕癥治療研究提供基礎。

與空白對照組相比，其余三組精子凋亡率都升高，產子數都有下降趨勢，睪丸內部組織也都出現(xiàn)了一定程度損傷。說明轉染試劑本身對小鼠睪丸有一定毒性。本文轉染條件源于試劑說明書的推薦，但能否通過進一步優(yōu)化轉染試劑用量以及miRNA用量來減小局部轉染對組織的毒性有待進一步研究。

活體基因局部轉染排除了傳統(tǒng)動物轉基因不穩(wěn)定、影響因素過多等多種弊端，試驗效果能更直接反應目的基因對靶標組織的影響，具有直觀方便等多種優(yōu)點，在分子醫(yī)學研究領域受到廣泛應用[10-12]。miRNA-383非睪丸特異性microRNA，已有大量研究表明其對多種組織功能的發(fā)揮以及腫瘤細胞的生成和凋亡其重要調控作用[13-15]，本文采取睪丸局部轉染的方式最大程度降低其對其它組織、其它系統(tǒng)的影響。miRNA-383過表達組8d和9d校正后平均體重比轉染對照組顯著下降，腎上腺有一定程度異常；miRNA-383抑制表達組，腎臟觀察到一定程度異常，肺臟指數和腎臟指數與轉染對照組差異顯著。說明睪丸轉染miRNA-383對健康KM小鼠正常機體有一定影響，而該影響具體發(fā)生機制和對機體影響程度有待進一步研究。但轉染前后4組小鼠生理生活、行為習慣等表現(xiàn)正常，沒有出現(xiàn)死亡、器官衰竭等其它嚴重病癥，表明該操作對小鼠機體總體影響不大。對比利用多種常見方法制作睪丸性不育小鼠模型后小鼠機體狀態(tài)[18-19]，可以看出該操作對小鼠正常機體影響較小。

4 結論

健康可育小鼠睪丸內miRNA-383表達量增加能顯著降低精子凋亡率，反之則增加。miRNA-383對雄鼠繁殖力起重要的正調控作用，通過睪丸轉染有望對雄鼠繁殖力進行人為干預。

【參考文獻】

[1]Gudeloglu A, Parekattil S J. Update in the evaluation of the azoospermic male[J]. Clinics, 2013, 68: 27-34.

[2]Hayashi K, Lopes SMCDS, Kaneda M,etal. MicroRNA biogenesis is required for mouse primordial germ cell development and spermatogenesis[J]. Plos One, 2008, 3(3):1738.

[3]Yang Q, Hua J, Wang L,etal. MicroRNA and piRNA profiles in normal human testis detected by next generation sequencing[J]. PloS one, 2013, 8(6): 66809.

[4]Lian J, Tian H, Liu L,etal. Downregulation of microRNA-383 is associated with male infertility and promotes testicular embryonal carcinoma cell proliferation by targeting IRF1[J]. Cell death & disease, 2010, 1(11): 94.

[5]Lian J, Zhang X, Tian H,etal. Altered microRNA expression in patients with non-obstructive azoospermia[J]. Reproductive Biology and Endocrinology, 2009, 7(1): 1-10.

[6]Tian H, Cao Y X, Zhang X S,etal. The targeting and functions of miRNA-383 are mediated by FMRP during spermatogenesis[J]. Cell death & disease, 2013, 4(5): 617.

[7]Azarbarzin S, Safaralizadeh R, Kazemzadeh M,etal. The Value of MiR-383, an Intronic MiRNA, as a Diagnostic and Prognostic Biomarker in Intestinal-Type Gastric Cancer[J]. Biochemical Genetics, 2017: 1-9.

[8]田卉. miRNA 和遺傳因素在男性不育發(fā)生中的功能研究[D]. 中國科學技術大學, 2014.

[9]Huang H, Tian H, Duan Z,etal. microRNA-383 impairs phosphorylation of H2AX by targeting PNUTS and inducing cell cycle arrest in testicular embryonal carcinoma cells[J]. Cellular signalling, 2014, 26(5): 903-911.

[10] Qin Q, Shi Y, Zhao Q,etal. Effects of CD25siRNA gene transfer on high-risk rat corneal graft rejection[J]. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology, 2015, 253(10): 1765-1776.

[11] Jiang Z, Chen C H, Chen Y Y,etal. Autophagic effect of programmed cell death 5 (PDCD5) after focal cerebral ischemic reperfusion injury in rats[J]. Neuroscience letters, 2014, 566:298-303.

[12] Tan C C, Zhang J G, Tan M S,etal. NLRP1 inflammasome is activated in patients with medial temporal lobe epilepsy and contributes to neuronal pyroptosis in amygdala kindling-induced rat model[J]. Journal of neuroinflammation, 2015, 12(1): 18.

[13] Jiang Y, Sang Y, Qiu Q. microRNA-383 mediates high glucose-induced oxidative stress and apoptosis in retinal pigment epithelial cells by repressing peroxiredoxin 3[J]. American Journal of Translational Research, 2017, 9(5): 2374.

[14] Ma H, Liu B, Wang S,etal. MicroRNA-383 is a tumor suppressor in human lung cancer by targeting endothelial PAS domain-containing protein 1[J]. Cell Biochemistry and Function, 2016, 34(8): 613-619.

[15] Fateh A, Hosseinpour Feizi M A, Safaralizadeh R,etal. Prognostic and Predictive Roles of MIR-383 in Colorectal Cancer[J]. 2016, 2016:1-14.

[16] 劉風華, 楊冬梓, 王沂峰, 等. 睪丸性不育動物模型的建立[J]. 中華男科學雜志, 2007, 13(2): 125-129.

[17] 曲榮鳳. 腺嘌呤誘導小鼠精原干細胞移植受體模型的建立[D]. 西北農林科技大學, 2014.