苑亞汝，徐后娟，侯欣，劉凱，劉成林，趙環(huán)宇，李建東，徐賽，王玉軍

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，植物保護(hù)學(xué)院，山東省泰安市泰山區(qū)岱宗大街61號(hào) 271018

石蠟制片法是一種廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物組織結(jié)構(gòu)研究的實(shí)驗(yàn)方法，石蠟切片在顯微鏡下可以清晰地觀測(cè)樣本組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)。但目前適用于煙草葉片的常規(guī)石蠟制片技術(shù)制作周期長(zhǎng)，從取材到封片整個(gè)制片過(guò)程大約需要9 d，且制作過(guò)程中使用的有毒試劑較多，如二甲苯、甲醛等，嚴(yán)重影響了制片效率和操作者健康。

目前利用微波法加快試劑滲透速率是縮短石蠟制片時(shí)間最為經(jīng)濟(jì)有效的方法?，F(xiàn)有研究多是對(duì)作用試劑或制片時(shí)間單一方面的優(yōu)化，尚缺少在改良試劑基礎(chǔ)上縮短制片時(shí)間的綜合性改良，且研究對(duì)象多集中在禾本科植物，在煙草中還未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)以煙草葉片為材料，在改進(jìn)常規(guī)石蠟制片法的基礎(chǔ)上結(jié)合微波作用的方法，探究一種適用于煙草葉片的微波快速石蠟制片技術(shù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)煙草為烤煙，品種為NC55。在同一葉片對(duì)稱部位打孔取樣，根據(jù)取樣的左右側(cè)將葉片分為A、B兩組，A組作為對(duì)照組用于常規(guī)石蠟制片法制片，B組作為試驗(yàn)組用于微波快速石蠟制片法制片，采用正丁醇替代二甲苯作為透明劑，采用松節(jié)油替代二甲苯作為脫蠟劑，與常規(guī)石蠟制片法不同的步驟見(jiàn)表1：

表1 微波快速石蠟制片法制片處理步驟Tab.1 Treatment step of rapid paraffin production method

2 結(jié)果

2.1 制片時(shí)間

兩種方法中各步驟試劑作用及實(shí)際操作耗時(shí)情況微波快速石蠟制片法將常規(guī)方法需要111.5 h的試劑作用時(shí)間縮短到142 min，顯著提高了制片效率。

2.2 切片質(zhì)量

常規(guī)石蠟制片法和微波快速石蠟制片法制作的切片在顯微鏡下的視野圖片顯示（圖1），在相同切片厚度時(shí)，兩種方法制作的石蠟切片在顯微鏡下均可清晰分辨表皮、海綿組織、柵欄組織、維管束。微波法制得的切片組織結(jié)構(gòu)完整，沒(méi)有明顯的變形或破裂，完整性和染色效果與常規(guī)方法制得的切片相似。2種方法切片的葉片、上表皮、下表皮、柵欄組織和海綿組織的厚度值在95%的置信區(qū)間下沒(méi)有顯著差異，表明微波法制得的切片在準(zhǔn)確度上和常規(guī)方法制得的切片相似。

3 結(jié)論

圖1 煙草葉片橫切面石蠟切片F(xiàn)ig.1 Paraffin section of cross section of tobacco leaves

本試驗(yàn)在常規(guī)石蠟制片技術(shù)的基礎(chǔ)上，改良作用試劑、加入微波處理，應(yīng)用于制作煙草葉片石蠟切片，在降低試驗(yàn)毒害、縮短制片周期的同時(shí)，取得了較好的制片效果，初步確立了一種適用于煙草葉片的微波快速石蠟制片方法，為煙草研究提供了一種更加安全、高效的新技術(shù)，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。