曹 麗 蘇 強 張亞萍 張鑫艷 程 凱 張曉延

(山西醫(yī)科大學汾陽學院,汾陽 032200)

近年來，胃癌的發(fā)病率顯著上升，在我國惡性腫瘤中占比較大，因在早期不易被發(fā)現(xiàn)，當就醫(yī)診斷時往往處于中晚期，而目前對于胃癌的診斷和治療仍依賴于傳統(tǒng)手段，存在治療效果不佳、副作用大等問題。因此目前迫切需要深入研究，尋找更加科學合理的早期診斷和預防治療的方案。

氯喹(Chloroquine，CQ)屬于4-氨基喹諾酮類藥，由兩個芳香環(huán)組成，是一種古老而應用廣泛的治療瘧疾的藥物。在自噬研究中，氯喹作為一種經(jīng)典的溶酶體抑制劑，抑制自噬體與溶酶體的融合，起到抑制自噬流的作用。近年有研究發(fā)現(xiàn)，氯喹可發(fā)揮抗腫瘤作用，有應用于腫瘤治療的前景[1]。已有研究表明氯喹能誘導胃癌細胞發(fā)生凋亡[2]，因此我們想到如果氯喹也能誘導正常細胞發(fā)生凋亡，將會在臨床應用中發(fā)生較嚴重的毒副作用。本研究中我們以正常胃上皮細胞為對照，觀察了氯喹是否對人胃癌HGC-27 細胞有特異性的促凋亡作用，以期待為胃癌的臨床治療提供新的參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人胃癌HGC-27 細胞和人正常胃上皮GES-1細胞由山西醫(yī)科大學汾陽學院張笑添老師饋贈，我課題組凍存培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:含10%胎牛血清的MEM和DMEM 培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱。

1.1.2主要試劑 MEM 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、無支原體胎牛血清(武漢博士德生物技術有限公司)；CCK-8試劑(博士德生物科技有限公司)；氯喹(上海中西制藥有限公司)；細胞線粒體膜電位檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)；PAGE凝膠配制試劑(賽默飛公司)；NC膜(PALL公司)；Caspase-3抗體、PARP抗體、LC3A/B抗體(CST公司)；GAPDH抗體(萬類生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1實驗分組 兩種細胞的實驗分組各為加溶劑對照組和用氯喹、雷帕霉素(Rapamycin，RAP)作用后的實驗組。細胞密度接近95%時將兩種細胞傳代至6孔板，每孔50萬個，12 h后細胞密度約90%時分別換成含1%血清的MEM維持液和DMEM 維持液培養(yǎng)，設對照組和處理組。

確定藥物處理方案：結合相關文獻以及我們前期的預實驗結果，觀察到用10 μmol/L的CQ和100 nmol/L的RAP藥物處理細胞72 h，細胞在形態(tài)以及生理指標上的變化差異最明顯，故選取此方案進行處理。

1.2.2使用倒置顯微鏡觀察CQ 處理后這兩種細胞形態(tài)學變化 細胞處理方法同1.2.1，設對照組和氯喹處理組。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.2.3采用DAPI核染色檢測CQ 對HGC-27 細胞凋亡的作用 細胞處理方法同1.2.1，設對照組和氯喹處理組，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，DAPI染核5 min，用PBS洗3遍后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4CCK-8法檢測細胞的增殖活性 選取處于對數(shù)生長期且活性大于95%的細胞進行實驗。用完全培養(yǎng)基調整細胞濃度為4×104ml-1，每孔100 μl加入96孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁后換成含1%血清的維持液。實驗分為3組，氯喹組：用10 μmol/L的CQ干預；RAP組：用100 nmol/L的RAP干預；對照組：不加藥物的溶劑作為對照。每組設2個復孔，作用72 h，在終止培養(yǎng)的前2 h，每孔加入10 μl的CCK-8試劑[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽]，在酶標儀450 nm波長下測定各孔的吸光度值，計算各孔平均OD 值，以對照組細胞活性為100%，計算各孔的細胞存活率。細胞存活率:細胞存活率/%=(實驗組A 值-陰性對照組A 值)/(空白對照組A值-陰性對照組A值)×100%。以上實驗重復3次。

1.2.5JC-1檢測CQ處理后細胞線粒體膜電位的變化 細胞處理方法同上。在氯喹作用細胞72 h后，吸除培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞1 次，加入0.5 ml細胞培養(yǎng)液，再加入0.5 ml JC-1 染色工作液，充分混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。孵育結束后，吸除上清，用JC-1 染色緩沖液洗滌2 次，加入1 ml細胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下通過熒光通道檢測，分別拍照。

1.2.6Western blot檢測凋亡相關蛋白 分別收集兩種細胞的對照組和處理組，加入60 μl RIPA 裂解液冰浴15 min，BCA法測定蛋白質濃度；樣品通過SDS-PAGE電泳分離，并轉移到硝酸纖維素膜(NC)上；膜用5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，然后分別孵育凋亡蛋白Caspase-3抗體，PARP抗體和GAPDH抗體以及LC3抗體，4℃過夜；清洗后，用辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗在室溫下孵育2 h；最后使用化學發(fā)光法顯影。

2 結果

2.1氯喹處理對GES-1細胞和HGC-27細胞形態(tài)的影響 10 μmol/L的CQ 分別作用于GES-1細胞和HGC-27細胞72 h后，鏡下可見：GES-1細胞氯喹組和對照組細胞貼壁生長情況較一致，細胞間連接緊密，細胞呈多角形，胞膜清晰，胞質飽滿，說明氯喹干預未明顯改變正常胃上皮細胞形態(tài)；而HGC-27氯喹組細胞與對照組細胞相比較，間隙增寬，懸浮細胞數(shù)目逐漸增多，細胞密度明顯減少，細胞逐漸萎縮變圓，胞質減少，失去正常細胞形態(tài)，顯示氯喹干預后胃癌細胞發(fā)生了較為明顯的形態(tài)改變(圖1)。

2.2核染色檢測CQ誘導的HGC-27細胞凋亡 10 μmol/L的CQ分別作用于GES-1細胞和HGC-27細胞72 h后，用DAPI熒光染色法檢測氯喹處理細胞后細胞核的變化。如圖2所示，與同種細胞對照組相比，氯喹組GES-1細胞核淺染、核大小形態(tài)均未發(fā)生變化；而氯喹組HGC-27細胞細胞核呈濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光，且細胞數(shù)目也減少。

2.3氯喹和雷帕霉素對GES-1和HGC-27細胞增殖活性的影響 分別用10 μmol/L CQ和100 nmol/L RAP處理GES-1和HGC-27細胞72 h，CCK-8試劑盒檢測結果顯示：CQ能抑制HGC-27細胞增殖(P<0.05)，對GES-1細胞的增殖活性無明顯抑制作用(P>0.05)。本研究將自噬誘導劑雷帕霉素作為氯喹干預的對照藥物，結果顯示雷帕霉素可明顯增加正常胃上皮細胞GES-1增殖活性(P<0.05)，而對胃癌HGC-27細胞的促增殖活性不明顯(P>0.05)(圖3)。結果提示氯喹對胃癌細胞的增殖活性抑制作用可能與抑制細胞自噬有關。

2.4JC-1檢測CQ處理后兩種細胞線粒體膜電位的變化 JC-1是檢測細胞膜電位變化的理想指示劑。JC-1在細胞內有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，當以低濃度的單體形式存在時會聚集于胞內發(fā)射綠色熒光，當進入線粒體以高濃度的多聚體形式存在時會發(fā)射紅色熒光，當發(fā)生凋亡時，細胞線粒體膜電位會下降，就會由紅色熒光向綠色熒光發(fā)生轉變[3]。10 μmol/L CQ作用GES-1細胞和HGC-27細胞72 h后，熒光顯微鏡下觀察可見，GES-1細胞中的紅色熒光和綠色熒光無明顯變化，而HGC-27細胞中的JC-1 出現(xiàn)從紅色熒光向綠色熒光轉變，說明CQ處理后HGC-27細胞發(fā)生了線粒體膜電位的下降(圖4)。

圖1 兩種細胞氯喹處理后的形態(tài)學變化(×20)Fig.1 Morphological changes of two cells after treated by CQ(×20)

2.5氯喹對胃癌細胞HGC-27凋亡相關蛋白水平的影響 由于氯喹和雷帕霉素是自噬相關藥物，為驗證這兩種藥物作用于兩種細胞后自噬發(fā)生情況，我們用10 μmol/L CQ和100 nmol/L RAP藥物作用于兩種細胞72 h后觀測自噬標記蛋白LC3的水平。與各自的對照組比較，氯喹組LC3Ⅰ型和Ⅱ型出現(xiàn)增多，表明自噬流被抑制，而雷帕霉素組出現(xiàn)了LC3Ⅰ型向Ⅱ型的轉變，表明細胞自噬的發(fā)生(圖5A)。隨后，研究了這兩種藥物作用于兩種細胞后凋亡蛋白的水平改變。藥物處理72 h后，CQ處理組和雷帕霉素處理組的GES-1細胞Caspase-3和PARP表達較對照組無明顯差異(P>0.05)；CQ處理組HGC-27細胞中凋亡蛋白Caspase-3和PARP表達較相同細胞對照組和雷帕霉素處理組均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5B、C。

圖2 兩種細胞氯喹處理后的細胞核染色變化(×20)Fig.2 Nuclear staining changes in two kinds of cells after treated with CQ(×20)

圖3 兩種藥物對GES-1和HGC-27細胞的細胞增殖活性的影響Fig.3 Proliferative activity of GES-1 and HGC-27 cells after 72 hNote: *.P<0.05.

圖4CQ處理后兩種細胞線粒體膜電位的變化(×20)

Fig.4EffectsofchloroquineonmitochondrialmembranepotentialofGES-1andHGC-27cells(×20)

Note: Counting certain cells randomly and calculating the ratio of red fluorescence to green fluorescent,*.P<0.05.

圖5 Western blot檢測兩種藥物處理GES-1細胞和胃癌細胞HGC-27細胞后凋亡蛋白的表達Fig.5 Expression of proteins in GES-1 and HGC-27 cells by Western blotNote:*.P<0.05.

3 討論

胃癌是威脅人類的十大癌癥之一，每年全球有近80萬例患者死于胃癌，這其中約有一半患者來自中國[4]。所以，找到一種新的有效治療方法是眾多科研工作者和臨床醫(yī)師一直努力的方向。CQ長期以來被用作抗瘧疾藥物,近年來又發(fā)現(xiàn)其可靶向溶酶體,通過改變溶酶體內pH值從而阻斷自噬溶酶體的形成和自噬體內容物的降解,可抑制自噬的晚期效應階段[5，7]。值得一提的是，已有研究表明氯喹已作為一種新的抗腫瘤藥物被應用于臨床試驗[8-10]。Zhang等[2]發(fā)現(xiàn)氯喹通過Toll樣受體9/NF-κB 信號轉導通路抑制MGC803胃癌細胞生長和遷移，并具有抗腫瘤活性；Zhu等[5]發(fā)現(xiàn)氯喹促進順鉑發(fā)揮抑制卵巢癌細胞生長、遷移的作用,通過氯喹抑制自噬從而增強順鉑的抗腫瘤效應。也有相同的研究報道見于其他腫瘤[11，12]，但均未觀察藥物對正常細胞的毒副作用。考慮到作為一種抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的選擇性作用越強，其應用價值才越高，故本研究以正常胃上皮細胞作為對照來進行研究。與預期相符，結果發(fā)現(xiàn)氯喹能誘導胃癌細胞HGC-27發(fā)生凋亡，這與Zhang等[2]、Ye等[3]研究結果相同。除此之外，更有意義的是本研究發(fā)現(xiàn)與氯喹對胃癌細胞的誘導凋亡和抑制增殖的作用不同的是，氯喹對正常胃上皮細胞無明顯地誘導細胞凋亡和細胞毒作用。這種對腫瘤細胞特異性的作用就為氯喹應用于臨床抗腫瘤治療提供了進一步的實驗基礎。

細胞自噬和凋亡是維持機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機制，干擾細胞自噬或凋亡會使細胞的生長代謝發(fā)生紊亂。通過擾亂腫瘤細胞自噬和凋亡的聯(lián)系，在一定程度上抑制腫瘤的生長，成為治療腫瘤的一種策略。氯喹和雷帕霉素是一對經(jīng)典的自噬抑制劑和自噬誘導劑，本研究以雷帕霉素為對照，探究了這兩種藥物對兩種細胞的不同作用。我們認為自噬的發(fā)生保護腫瘤細胞，阻止其發(fā)生凋亡。有學者發(fā)現(xiàn)小劑量的CQ通過抑制自噬可增強苦參堿誘導的凋亡[13]。他們的研究中使用小劑量的氯喹與其他抗腫瘤藥物連用也可以起到誘導腫瘤細胞凋亡的效果。因此，我們推測低劑量的氯喹可以部分抑制自噬體內容物的降解，但還不足以直接誘導腫瘤細胞的凋亡，而我們實驗中使用的中等劑量的氯喹可較強的阻斷自噬溶酶體的形成和自噬體內容物的降解，使之積聚在胞內，直接導致腫瘤細胞的凋亡。

Caspase-3和PARP 都是細胞發(fā)生凋亡的重要標志。PARP，即聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(Poly ADP-ribose polymerase)，是細胞凋亡核心成員胱天蛋白酶(Caspase)的切割底物。本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)氯喹作用于兩種細胞72 h后，胃癌細胞HGC-27中凋亡相關蛋白酶Caspase-3和凋亡底物PARP發(fā)生降解，提示氯喹誘導的胃癌細胞凋亡與Caspase途徑有關聯(lián)。有研究表示許多抗腫瘤藥物作用于腫瘤細胞后能誘導細胞內產(chǎn)生ROS，ROS會使線粒體功能喪失如線粒體跨膜電位的變化，細胞色素C從線粒體釋放至細胞質，然后這種釋放會引發(fā)Caspase活化、DNA的斷裂，最終導致細胞發(fā)生凋亡[14，15]。因此接下來我們進一步探究了氯喹作用于胃癌細胞HGC-27后是否通過這一機制來誘導胃癌細胞HGC-27凋亡。

我們以正常胃上皮細胞GES-1作為對照細胞，運用DAPI染色、CCK-8試驗以及JC-1膜電位變化、蛋白印跡Western blot等試驗方法驗證了氯喹可以誘導胃癌細胞發(fā)生凋亡并抑制其細胞活力，而對正常胃上皮細胞無明顯作用。這種差異提示在兩種細胞中自噬溶酶體受抑制后的活動不同，但具體的機制仍需進一步實驗探索。氯喹能抑制胃癌細胞的自噬溶酶體形成階段誘導胃癌細胞發(fā)生凋亡，提示自噬溶酶體在自噬和凋亡調控之間發(fā)揮著重要的作用，我們接下來將對這種調控的機制做進一步的研究探索，以從自噬和凋亡調控的角度為癌癥的臨床治療提供更多的參考。

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