劉衛(wèi)紅，崔 琳，申意彩，丁 玉，馬春芬

(1.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000； 2.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046；3.黃河科技大學，河南 鄭州 450006; 4.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome, PCOS)是以排卵障礙、卵巢呈多囊性變化、高雄激素血癥等為主要特征的內(nèi)分泌紊亂綜合征[1]。PCOS病因復雜，致病原因至今仍不明確。在眾多免疫細胞因子中，轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)是公認的組織器官纖維化的關(guān)鍵因素，被認為與PCOS發(fā)病密切相關(guān)，可能參與了PCOS的卵泡發(fā)育、卵泡膜細胞分化、雄激素產(chǎn)生、胰島素抵抗及卵巢組織纖維化等過程。有研究[2]發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 能促使PCOS模型小鼠的卵巢纖維母細胞膠原生物合成而導致卵巢纖維化。祛痰化瘀方臨床治療PCOS有較好療效。本研究采用脫氫表雄酮造模法制作大鼠PCOS模型，研究祛痰化瘀方對PCOS模型大鼠動情周期、激素水平及卵巢纖維化相關(guān)因子的影響。

1 材料與方法

1.1 動 物

雌性SPF級21日齡大鼠80只，體質(zhì)量(50±20)g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號SYXK(豫)2010-0002，合格證號41003100001497。

1.2 藥品、試劑與儀器

祛痰化瘀方由桂枝、茯苓、牡丹皮、炒桃仁、赤芍、車前草等組成，由河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供，水煎濃縮至質(zhì)量分數(shù)為2.27 g/mL，4.54 g/mL，4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩Ｑ宕俾雅萆伤?FSH)、促黃體生成素(LH)、睪酮(T)ELISA試劑盒，由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供，96孔，批號20150110，20150201，20150104；TGF-β1，Pepro Tech公司，產(chǎn)品編號HB018834；免疫組化試劑盒、DAB顯色液，均購自武漢博士德生物工程有限公司，編號依次為SX001352、SX000252；MK3型全自動酶標板分析儀，Multiskan；CK40型倒置顯微鏡，Olympus；TB-718E型生物組織自動包埋機，湖北泰維科技實業(yè)有限公司；Leica RM2245輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機，產(chǎn)地德國。

1.3 模型的建立、分組與給藥

雌性SPF級21日齡大鼠58只，自22日齡開始模型組每天頸背部皮下注射脫氫表雄酮(DHEA)試劑(60 μg/g體質(zhì)量+0.2 mL注射油劑)，連續(xù)20 d ，建立PCOS大鼠模型?？瞻讓φ战M22只大鼠每天皮下注射0.2 mL注射油劑。造模結(jié)束后，分別從模型組、空白對照組各隨機選取10只大鼠進行模型評估。

造模結(jié)束后，將模型組剩余48只大鼠隨機分為二甲雙胍組，模型對照組，祛痰化瘀方高、低劑量組，將空白對照組剩余12只大鼠作為空白對照組。各組一同進行藥物干預實驗。根據(jù)Bios法計算大鼠千克體質(zhì)量劑量，按大鼠體質(zhì)量計算用藥劑量。祛痰化瘀方高、低劑量組依次給以4.54，2.27 g/mL生藥灌胃，二甲雙胍組以0.2 g/kg灌胃，空白對照組、模型對照組灌胃等體積生理鹽水，1 d 1次，連續(xù)28 d。

1.4 檢測指標

1.4.1 動情周期

經(jīng)祛痰化瘀方連續(xù)灌胃28 d后，各組大鼠均于每日清晨9:00進行陰道脫落細胞涂片并進行觀察，連續(xù)10 d，鏡下觀察正常組和模型組并進行比較。

1.4.2 血清FSH、LH、T水平

灌胃結(jié)束后，各組大鼠禁食水12 h，腹主動脈取血5 mL，2 000 r/min離心20 min，分離血清，-20 ℃保存，檢測血清FSH、LH、T水平，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.3 卵巢間質(zhì)TGF-β1表達

腹主動脈取血后，取大鼠左側(cè)卵巢，置于多聚甲醛固定，以卵巢最大平面為待檢測面，常規(guī)石蠟包埋，行免疫組織化學染色。每個卵巢標本于30倍鏡下選擇5個視野進行拍照，各組大鼠隨機選取30個鏡下視野測定卵巢間質(zhì)TGF-β1表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

實驗過程中，模型對照組和祛痰化瘀方低劑量組各有1只大鼠死亡，經(jīng)解剖，發(fā)現(xiàn)是灌胃時誤入肺部造成。

2.1 動情周期

陰道涂片結(jié)果：祛痰化瘀方2個劑量組和二甲雙胍組的大鼠恢復規(guī)律的動情周期，而模型對照組大鼠仍無明顯的動情周期或動情周期延長。

2.2 各組大鼠FSH、LH、T水平對比

FSH水平：與模型對照組對比，空白對照組和藥物組血清FSH水平升高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與二甲雙胍組對比，祛痰化瘀方高劑量組的FSH降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；低劑量組的FSH較之差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。祛痰化瘀方低劑量組FSH水平較高劑量組升高，但差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 LH水平：與模型對照組對比，空白對照組、二甲雙胍組、祛痰化瘀方高劑量組血清LH水平均降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01);祛痰化瘀方低劑量組較之差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。祛痰化瘀方低劑量組LH高于二甲雙胍組(P<0.01)，祛痰化瘀方高劑量組LH水平稍高于二甲雙胍組(P<0.05) 。T水平：與模型對照組對比，空白對照組和祛痰化瘀方高劑量組血清T水平降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

組 別動物數(shù)/只FSH/(IU·L-1)LH/(IU·L-1)T /(μg·L-1)空白對照組122.93±0.60***##△△5.68±0.30***#△△△1.57±0.27**###△△△模型對照組112.06±0.54###△△△6.99±0.54***###△4.01±3.86#△二甲雙胍組123.58.±0.61***△5.33±0.55***###△△△2.11±0.33*△祛痰化瘀方低劑量組113.60±0.87#***6.54±0.50*###△△△2.05±0.45*#祛痰化瘀方高劑量組122.94±0.86***##△5.91±0.43***##△△△1.68±0.30**###△△

注：與模型對照組對比，*P>0.05，**P<0.05，***P<0.01；與二甲雙胍組對比，#P>0.05，##P<0.05，###P<0.01；與祛痰化瘀方低劑量組對比，△P>0.05，△△P<0.05，△△△P<0.01

2.3 各組大鼠卵巢間質(zhì)TGF-β1表達水平對比

二甲雙胍組、祛痰化瘀方2個劑量組、空白對照組大鼠的TGF-β1與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明PCOS大鼠卵巢形態(tài)變化與TGF-β1有關(guān)。祛痰化瘀方高劑量組大鼠的TGF-β1與二甲雙胍組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01);而祛痰化瘀方低劑量組與二甲雙胍組對比，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。表明：在治療卵巢纖維化方面，祛痰化瘀方高劑量組效果最好，二甲雙胍組次之，祛痰化瘀方低劑量組效果不如二甲雙胍組。見表2。

組 別動物數(shù)/只OD(光密度值)空白對照組301.52±0.25***###△△△模型對照組305.55±3.32###△△△二甲雙胍組303.42±1.43***△祛痰化瘀方低劑量組303.75±1.47***###△△△祛痰化瘀方高劑量組301.80±0.75***###△△△

注：與模型對照組對比，***P<0.01；與二甲雙胍組對比，###P<0.01；與祛痰化瘀方低劑量組對比，△P>0.05，△△△P<0.01

3 討 論

多囊卵巢綜合征是一種病因復雜的內(nèi)分泌紊亂性疾病。西醫(yī)學認為：促黃體生成素及雄激素升高是PCOS患者的基本病理生理特點，是嚴重影響患者生殖功能的根本原因。過高的促黃體生成素水平，刺激卵巢泡膜細胞功能亢進，引起卵巢多囊性改變及高雄激素血癥；卵泡激素調(diào)控卵巢顆粒細胞的功能受阻，引起月經(jīng)紊亂、排卵異常及生育障礙[3]。近年來,國內(nèi)不少研究均顯示：TGF-β1參與PCOS的發(fā)生及發(fā)展，卵巢的卵泡膜和顆粒細胞可產(chǎn)生、分泌 TGF-β1，通過自分泌和旁分泌的調(diào)節(jié)方式，加強由FSH誘導的雌激素的分泌過程。崔蓉等[4]發(fā)現(xiàn)：PCOS 組外周血及腹腔液中 TGF-β1 含量高于正常對照組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Ong VH[5]認為： PCOS 卵巢纖維化及包膜增厚與 TGF-β1相關(guān)。本實驗通過觀察TGF-β1在各組大鼠卵巢中的表達發(fā)現(xiàn):在PCOS模型大鼠間質(zhì)細胞中TGF-β1的表達明顯高于空白對照組、祛痰化瘀方高、低劑量組及二甲雙胍組(P<0.01)，這與文獻報道結(jié)果一致[6]。

根據(jù)PCOS的臨床表現(xiàn)可將其歸屬于中醫(yī)學“月經(jīng)后期”“閉經(jīng)”“崩漏”“不孕”“癥瘕”等范疇。發(fā)病主要與腎、肝、脾相關(guān)，痰濕阻滯可導致物質(zhì)代謝障礙，瘀久化熱從而產(chǎn)生濕熱內(nèi)阻的征象，進而影響血液流通或?qū)е卵吼こ矶仍龈?，從而形成血瘀。瘀血、痰濕停于肌膚則形體肥胖、多毛、痤瘡；停于子宮、卵巢就會出現(xiàn)卵巢包膜增厚，排卵障礙。有研究[7-9]表明:沒有血瘀證表象的的PCOS患者在治療中適當運用活血化瘀中藥可以增加卵巢組織局部的血流量，使卵巢包膜厚度變薄，促進卵泡發(fā)育成熟以及誘發(fā)排卵、促黃體發(fā)育，提高治療效果。由此得知：在PCOS發(fā)病中，血瘀是重要的致病因素。PCOS患者多肥胖，肥胖之人多痰濕，“脾虛不運，痰濕阻滯”是肥胖的根本[10]。有文獻[11]報道：PCOS的患者減輕原來體質(zhì)量的5%就有望恢復月經(jīng)、排卵，甚至有妊娠的可能?，F(xiàn)代藥理研究[12]發(fā)現(xiàn)：利濕祛痰中藥具有降脂功能，可以通過激活蛋白激酶抑制肝細胞中三酰甘油合成，從而降低血脂水平，改善高胰島素血癥。馬春芬教授根據(jù)豐富的臨床經(jīng)驗，自擬祛痰化瘀方治療PCOS療效顯著，方中敗醬草、車前草、野菊花、生薏苡仁合用，可清熱解毒，化痰除濕；澤瀉、牡丹皮、桃仁、三棱、莪術(shù)配伍，可清熱涼血，破瘀通經(jīng)；赤芍、茯苓、桂枝三藥合用，可祛瘀逐水，溫陽散結(jié)；甘草調(diào)和諸藥。全方共奏清熱利濕、通調(diào)化痰、活血消瘀之效。實驗結(jié)果顯示：通過對大鼠陰道涂片的觀察發(fā)現(xiàn)，PCOS大鼠經(jīng)過祛痰化瘀方及二甲雙胍治療后，動情周期基本恢復規(guī)律；血清LH升高變化與文獻報道一致，且祛痰化瘀高劑量組LH水平高于二甲雙胍組，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；二甲雙胍、祛痰化瘀方高劑量、祛痰化瘀方低劑量對多囊卵巢綜合征大鼠升高的FSH水平均有療效，與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。祛痰化瘀方高劑量組、空白對照組大鼠血清T水平與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。祛痰化瘀方高劑量組卵巢間質(zhì)TGF-β1的表達降低最為明顯，與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；低劑量組與二甲雙胍組對比，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

綜上所述，祛痰化瘀方是治療多囊卵巢綜合征的有效方劑，可以降低PCOS模型大鼠血清促黃體生成素水平和睪酮水平，恢復大鼠動情周期，恢復排卵功能，且祛痰化瘀方高劑量較低劑量降促黃體生成素效果更理想，能升高PCOS大鼠血清促卵泡生成素水平，降低TGF-β1在PCOS大鼠卵泡模細胞及間質(zhì)細胞中的表達，使包膜增厚、間質(zhì)纖維化的卵巢趨于正常。在治療卵巢纖維化方面，祛痰化瘀方高劑量組效果最好，二甲雙胍組次之。

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