朱曉駿 張 鑫 周振華 金樹根 高雅婷 孫學(xué)華 楊婉鳳 高月求△

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病科 (上海, 201203) 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院細胞免疫實驗室

據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球約有2.4 億慢性HBV 感染者[1]，每年約有65 萬人死于HBV 感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝細胞癌( HCC)[2]，我國有慢性HBV 感染者約9300 萬人，其中慢性乙型肝炎(CHB) 患者約2000 萬例[3]，CHB治療的關(guān)鍵是抗病毒，核苷(酸)類似物在臨床上廣泛應(yīng)用，但血清轉(zhuǎn)換率低、停藥問題困擾著臨床醫(yī)生，中醫(yī)藥在我國乙型肝炎防治中發(fā)揮著重要作用。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)靈貓方與恩替卡韋聯(lián)合治療CHB具有協(xié)同作用[4]，因此我們進一步研究了靈貓方治療CHB的免疫學(xué)機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞 HepG2中科院上海細胞庫購買。

1.2 質(zhì)粒 pHBV1.3-pCR2.1質(zhì)粒，華中科技大學(xué)同濟醫(yī)院附屬協(xié)和醫(yī)院病毒研究室惠贈[5]。

1.3 藥物與試劑 靈貓方(醋青皮，胡黃連各9 g，貓爪草、黃芪、仙靈脾、女貞子各15 g)，由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院制劑工程中心加工提取水提物。方法如下：中藥材加入10倍的80%乙醇回流提取兩次，每次1.5 h。藥液通過80目過濾，減壓濃縮至2L，-20 ℃冷凍干燥，-70 ℃冷藏備用。

DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)；AMV First Strand cDNA Synthesis Kit(美國)；SG Fast qPCR Master Mix(High Rox) (2X) [生工生物工程(上海)股份有限公司，中國]；HBsAg和HBeAg ELISA試劑盒(雅培，美國)；Lipofectamine?3000(ThermoFisher，美國)。

1.4 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(HF151)，Heal Force公司；潔凈工作臺(SA-1480-2)，上海凈化設(shè)備廠；雅培i2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，美國；ABI 7500型熒光定量PCR儀，美國。

1.5 pHBV1.3-pCR2.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2 依據(jù)Lipfectamine 3000 Reagent 轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。

1.6 細胞培養(yǎng)、分組和干預(yù) HepG2細胞接種于6孔板，每孔5×105個細胞，加入1 ml含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；在37 ℃、5%CO2和100%濕度的條件下培養(yǎng)24 h。共分為3個組：靈貓方低劑量組(0.25mg/ml)、靈貓方高劑量組(0.5mg/ml)和空白對照組(0.9%NaCl)。分別向空白對照組、低劑量組、高劑量組加入0.9%NaCl溶液、0.25mg/ml和0.5mg/ml靈貓方水提物干預(yù)HepG2細胞，培養(yǎng)24h，然后pHBV1.3-pCR2.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h，收集細胞和上清液。

1.7 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.7.1 HBsAg、HBeAg水平 采用ELISA法檢測HBsAg和HBeAg水平，方法按照試劑盒說明書進行。

1.7.2 RNA提取和 IFN-α、IFN-β、IFN-λ1、OAS1、MxA、RIG-ImRNA定量 按照Trizol說明書提取總RNA，取1 μl總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取2 μl的cDNA進行PCR反應(yīng)。PCR擴增：第1步3 min，95 ℃，第2步95 ℃、7 s變性，57 ℃、10s退火，72 ℃、15 s延伸，40個循環(huán)，根據(jù)2-△△Ct法，以 β-actin作為內(nèi)參照，檢測IFN-α、IFN-λ1、OAS1、MxA、PRK、RIG-ImRNA的表達量。引物詳見表1。

表1 RT-PCR引物(10.5 PCR 3.20PCR)

2 結(jié)果

2.1 3組轉(zhuǎn)染HepG2細胞分泌HBsAg、HBeAg情況 見圖1。與空白對照組比較，高、低劑量靈貓方組的HBsAg和HBeAg水平明顯下降；與低劑量靈貓方組比較，高劑量靈貓方組的HBsAg、HBeAg水平更低，這提示高、低劑量的靈貓方可抑制轉(zhuǎn)染HepG2細胞分泌HBsAg、HBeAg，且高劑量靈貓方作用更強。

與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與低劑量靈貓方組比較，△P<0.05

圖1 3組轉(zhuǎn)染HepG2細胞分泌HBsAg、HBeAg水平

2.2 2組轉(zhuǎn)染HepG2細胞分泌IFN-αmRNA、IFN-βmRNA、IFN-λ1情況 見圖2。

與空白對照組比較，**P<0.01；

圖2 2組轉(zhuǎn)染HepG2細胞分泌IFN-αmRNA、IFN-βmRNA、IFN-λ1mRNA水平

2.3 2組轉(zhuǎn)染HepG2細胞分泌OAS1、MxA、PRKmRNA情況 見圖3。

與空白對照組比較，**P<0.01

圖3 2組轉(zhuǎn)染HepG2細胞OAS1、MxA、PRKmRNA相對表達量

2.4 2組轉(zhuǎn)染HepG2細胞分泌RIG-ImRNA情況 見圖4。

與空白對照組比較，**P<0.01

圖4 2組轉(zhuǎn)染HepG2細胞RIG-ImRNA圖相對表達量

3 討論

清熱解毒利濕健脾法可以起到改善肝功能、明顯減輕或消除臨床癥狀的良好效果,但無法使HBV得到抑制,在臨床治療中，在清熱化濕健脾基礎(chǔ)之上應(yīng)用補腎法往往能提高療效。王靈臺教授提出“補腎法”治療CHB[6]，靈貓方就是在此基礎(chǔ)之上創(chuàng)立。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為人體免疫功能低下系屬機體正氣不足，而人體之正氣源于脾腎，充實腎精腎氣，健運脾胃可能是提高機體免疫功能，清除或抑制HBV，促使病情改善和恢復(fù)的有效途徑[6]。 天然免疫應(yīng)答在機體抗病毒免疫中發(fā)揮著重要作用。入侵病毒的病原體相關(guān)分子模式(PAMP)會被機體的模式識別受體(PRRs)識別，從而啟動天然免疫應(yīng)答，如通過分泌干擾素等細胞因子抵御病毒的入侵[7]。干擾素通過信號通路引起下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達，從而起到抗病毒的作用[8]。OAS1、MxA、PRK 均為干擾素的效應(yīng)蛋白；慢性HBV 感染者的天然免疫應(yīng)答是受到損傷的[9，10]，恢復(fù)慢性HBV 感染者的天然免疫應(yīng)答是治療CHB方法之一。我們研究發(fā)現(xiàn)靈貓方可以明顯增加肝細胞I、III型干擾素的產(chǎn)生，其干擾素的效應(yīng)蛋白也明顯升高，因此推測靈貓方是通過增強天然免疫抑制HBV復(fù)制。

HBV 可通過自身HBeAg 和HBx 等多種蛋白成分，干擾Toll 樣受體( TLRs) 和維甲酸誘導(dǎo)基因( RIG-I) 兩種抗病毒信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，來抑制天然免疫應(yīng)答的強度[11]。RIG-I介導(dǎo)的干擾素誘導(dǎo)通路主要是在細胞質(zhì)內(nèi)，RIG-I可識別HBVpgRNA的50-ε結(jié)構(gòu)域，誘導(dǎo)III型干擾素的形成[12]。RIG-I-IFN-β信號通路在慢性HBV感染者中的功能受到損傷[13]。我們的研究發(fā)現(xiàn)靈貓方高、低劑量組細胞胞質(zhì)中的RIG-I mRNA明顯提高，因此推測靈貓方可能是通過提高RIG-I的表達，恢復(fù)RIG-I-IFN-β信號通路，增加干擾素合成，增強天然免疫功能，從而起到抗HBV的作用。

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