王朝陽 朱美意 歐陽軍 張宏偉

石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普通外科（新疆石河子 832000）

肝臟是機體執(zhí)行解毒和代謝自穩(wěn)態(tài)功能的主要器官［1］，參與多種物質代謝及凝血因子的合成［2-3］，而肝損傷是威脅我國人民健康的重大疾病之一［4］。雖然肝臟具有強大的儲備功能及再生能力［5］，但其再生修復的分子機制目前尚未完全清楚，如何促進肝損傷后的再生修復已成為臨床亟待解決的問題，成為近年來的研究熱點。

WIBRAND等［6］對肝臟研究發(fā)現(xiàn)，胚胎期小鼠Neuritin基因的表達水平隨著肝臟的發(fā)育而逐漸增高，至成年期時達到頂峰，隨后將成年小鼠肝臟70%切除，發(fā)現(xiàn)Neuritin基因的表達水平出現(xiàn)一過性降低，隨著肝臟再生的開始其表達水平開始回升并且回升的時間與cyclinD1一致，而cyclinD1是肝臟發(fā)育成熟和再生的一個重要指標。由此推測Neuritin可能具有促進肝臟再生的作用，而Neuritin作為神經營養(yǎng)因子在人體內多個器官表達，其研究主要集中在神經系統(tǒng)，在肝損傷及修復過程中的變化及作用國內外幾乎處于空白。本課題組于1999年在國內首先克隆了Neuritin基因［7］，并通過酵母雙雜交技術在酵母菌體內構建了Neuritin真核表達系統(tǒng)，獲得了分泌型Neuritin蛋白，進一步［8］以Neuritin為誘餌發(fā)現(xiàn)了Neuritin與細胞增殖和分化以及信號轉導相關的蛋白質均有相互作用，其中包括熱休克蛋白60（heat shock proteins 60，HSP60）。HSP60屬于熱休克蛋白家族中的一種，是機體在各種理化因子刺激下產生的一類高度保守的蛋白質［9-11］，其最主要的功能是作為分子伴侶［12］，參與新生肽鏈的折疊與裝配、對變性蛋白的修復或加速其降解、促進損傷細胞的自我修復，以保護機體在各種有害因素刺激時不受或少受傷害［13］，但目前國內對HSP60的研究卻相對較少，而在肝損傷修復中的研究國內外卻少有涉及。

因此，基于上述研究，筆者推測Neuritin與HSP60在肝損傷修復方面可能功能相關、共同參與并促進了肝損傷的再生修復，但是缺乏必要的客觀線索或依據(jù)，迄今尚未見任何研究將它們有意識地進行比較和聯(lián)系，更未見兩者在肝損傷修復中的研究與報道，故筆者將研究集中于兩者在肝損傷修復上，在繼酵母雙雜交之后，本研究利用免疫印跡技術（Western blot）檢測Neuritin與HSP60在肝損傷修復過程中的表達變化差異，探討兩者在肝損傷修復過程中的意義及可能機制，為深入研究肝損傷修復的分子機制奠定實驗基礎、提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 Sprague-Dawley（SD）大鼠購自新疆醫(yī)科大學動物飼養(yǎng)中心；Neuritin、HSP60抗體（Abcom公司）；蛋白分子量marker（Fermantes公司），β-actin抗體（SIGMA公司）；PVDF膜（Solarbio公司）；化學發(fā)光檢測試劑盒Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模及標本采集 由新疆醫(yī)科大學動物飼養(yǎng)中心提供同一批次（批號XJZZQ（XK）200301）5周齡、清潔級、雌雄不限的SD大鼠，體質量（200±20）g，經石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院動物飼養(yǎng)中心分籠飼養(yǎng)，保持12 h光照、12 h避光循環(huán)，恒溫恒濕、標準飼料、自由飲水，經適應性飼養(yǎng)1周后，按照隨機抽樣原則將其分為空白組（n=6）和實驗組（n=42），空白組為0 h觀察點，其中實驗組均行肝左葉70%切除以誘導急性肝損傷［14］，分別于術后6、12、24、48 h及3、7、14 d再次手術切除殘余肝左葉，部分肝臟標本用于Western Blot檢測，一部分于10%福爾馬林固定，常規(guī)包埋、切片行HE染色。相應時間點從尾緣靜脈采血約1 mL、室溫靜置30 min后3 000 r/min離心10 min，取血清送往石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，由專業(yè)檢驗人員利用全自動生化分析儀檢測ALT、AST濃度。所有大鼠均通過石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核。

1.2.2 肝組織HE染色 取肝組織石蠟塊，制備切片（4 μm），蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察肝組織病理學變化。

1.2.3 Western Blot取各時間點肝組織標本約50 mg，提取蛋白后混勻，于10%和15%的SDS-PAGE中電泳，電轉至PVDF膜中，5%脫脂奶粉封閉2 h后加入一抗（Neuritin抗體1∶500、HSP60抗體1∶20 000、β-action抗體1∶1 000），室溫孵育4～6 h，TBST洗膜4次，每次15 min；加入HPR標記的二抗，孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，最后用ECL發(fā)光試劑盒顯影檢測蛋白印跡條帶，以目的蛋白和內參β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 各組大鼠均進入統(tǒng)計分析，中途無遺失，應用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示；不同時間點之間的比較采用單因素ANOVA檢驗，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，采用Pearson方法分析Neuritin、HSP60分別與ALT、AST相關性，所有檢驗以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 急性肝損傷修復模型的鑒定

2.1.1 術后行為學觀察及存活率統(tǒng)計 與空白組相比，實驗組大鼠毛發(fā)略凌亂、光澤度降低，精神萎靡、嗜睡，活動量減少，對外界刺激反應遲鈍，初次及二次術后所有大鼠均存活，切口愈合良好，無感染滲血等并發(fā)癥的發(fā)生，二次術后精神、活動及食欲恢復良好，14 d存活率為100%。

圖1 肝左葉70%切除術誘導急性肝損傷Fig.1 Development of an acute liver-injury model by resection of the 70%left hepatic lobe

2.1.2 血液生化檢查 空白組及肝損傷組各個時間點ALT和AST水平變化，見表1。在各個時間段，6 h時，肝損傷組ALT、AST水平較空白組有顯著升高（P＜0.05），并且在12、24 h時持續(xù)升高（P＜0.05），48 h繼續(xù)升高并達到高峰（P＜0.05），提示造模成功；3 d時開始下降、7 d時繼續(xù)下降，但仍顯著高于空白組（P＜0.05）；14 d幾乎恢復正常，但差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

在各時間點，ALT、AST組間兩兩比較，14 d時ALT、AST與0 h比較差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。

2.1.3 病理分析 圖2顯示：空白組肝組織結構正常，肝細胞輪廓清晰，形態(tài)較為規(guī)則，胞漿均勻紅染，細胞核大小正常，核質淡染，肝細胞無變性、壞死等；肝細胞索排列整齊并以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉結構清晰呈多邊形，大小基本一致，小葉間分界清楚，整個肝無明顯充血、變形、壞死病理改變。實驗組可見正常肝小葉結構紊亂，出現(xiàn)灶狀壞死，肝小葉界限模糊、扭曲變形，中央靜脈偏離或消失，肝細胞索排列紊亂，失去正常放射狀排列，肝細胞變性、壞死，細胞核偏心分布，部分細胞胞核消失，間質充血伴有炎癥細胞浸潤，肝竇擴張其內紅細胞淤積，肝竇腔隙消失，肝臟組織結構明顯破壞，甚至出現(xiàn)大片狀壞死。

表1 各組大鼠血清ALT/AST表達Tab.1 Serum ALT and AST levels in rats x±s

2.2 Neuritin與HSP60在肝損傷修復過程中的表達變化差異 與空白組對比，Neuritin在肝損傷后6、12、24、48 h的表達量逐漸降低，并在48 h時達到最低，在損傷后3、7、14 d其表達量逐漸升高（F=172.195，P＜ 0.05）；HSP60在肝損傷后6、12、24、48 h的表達量逐漸升高，并在48 h時表達最高，在損傷后3、7、14 d其表達量逐漸下降（F=130.731，P＜ 0.05）。見圖3。

圖2 各組大鼠臟組織H E染色Fig.2 Histological changes were analyzed by HE

圖3 Neuritin與HSP60在肝損傷修復過程中的表達變化差異Fig.3 Analysis of Neuritin and HSP60 proteins expression in acute liver injury

2.3 Neuritin、HSP60與肝損傷的相關性 相關性分析顯示，在肝損傷后 6、12、24、48 h、3、7、14 d，HSP60的表達變化趨勢與血清ALT、AST的變化趨勢之間存在顯著正相關性（r=0.898 1，P＜0.001）、（r=0.925 2，P＜0.001），說明HSP60的表達變化與肝損傷修復的進程密切相關；Neuritin的表達變化趨勢與血清ALT、AST的變化趨勢之間存在顯著的負相關性（r=-0.813 1，P＜ 0.001）、（r=-0.832 3，P＜0.001），說明Neuritin的表達變化也與肝損傷修復的進程密切相關。見圖4。

圖4 Neuritin、HSP60與ALT、AST相關性分析（Pearson相關）Fig.4 Neuritin and HSP60 expression levels in relation to acute liver injury

2.4 Neuritin與HSP60在肝損傷修復過程中的相關性 相關性分析顯示，在肝損傷后6、12、24、48 h、3、7、14 d，Neuritin的表達變化趨勢與HSP60的表達變化趨勢之間存在顯著的負相關性（r=-0.060 5，P＜0.001），說明Neuritin與HSP60在肝損傷修復過程中的表達變化趨勢密切相關。見圖5。

圖5 Neuritin與HSP60的相關性分析（Pearson相關）Fig.5 Neuritin expression levels in relation to HSP60

3 討論

急性肝損傷是導致患者死亡的重要原因之一［15-16］，多種原因可引起肝功能異常和肝損傷［17］，如藥物性損傷、免疫性損傷、外傷暴力損傷等等，其具體機制異常復雜，目前尚未完全清楚，更不清楚損傷后再生修復的確切分子機制［18-20］。因此，建立穩(wěn)定、有效的急性肝損傷修復動物模型是研究其損傷機制、再生以及防治的關鍵性技術［21］。本實驗采用單純性肝葉部分切除術建立急性肝損傷修復模型，該方法不需要解剖及阻斷肝門，操作簡單、成功率高，與傳統(tǒng)的Pringle法［22］相比有效地避免了肝臟缺血再灌注的損傷和術后殘肝細胞再生不良。當肝細胞發(fā)生損傷時，肝細胞膜通透性增加，ALT和AST即從細胞內逸出，使血液ALT、AST水平升高［23］，在一定程度上反映了肝細胞的損傷程度［3］，而血液ALT、AST升高被認為是判斷急性肝損傷嚴重程度的經典指標［24］，其隨時間變化的趨勢反映出損傷后再生修復的啟動及進展［25］。與空白組比較，實驗組ALT、AST含量顯著升高并于術后48 h達到高峰，進一步肝組織病理學檢測發(fā)現(xiàn)，空白組肝組織正常，而肝損傷組肝小葉結構破壞及肝細胞腫脹、壞死，在術后48 h最為明顯，提示肝損傷逐漸加重并于術后48 h最重，血液生化及病理改變確定了該損傷模型的成立。

當機體受到有害因素刺激時，細胞內HSPs合成增加，它能保護機體（或細胞）不受或少受有害因素的傷害［13］。實驗組在肝損傷后 6、12、24、48 h，其血清ALT、AST不斷升高，病理組織顯示肝臟損傷程度不斷增加，表明肝損傷在逐漸加重，此時HSP60的表達量也逐漸上升，并且在第48小時時肝損傷程度與HSP60表達量同步達到高峰，可能是其對肝臟應激保護作用逐漸增強的表現(xiàn)。在肝損傷后3、7、14 d，其血清ALT、AST和病理組織顯示肝臟的損傷程度逐漸降低，表明肝損傷在逐漸修復，此時HSP60的表達量也逐漸下降，說明可能隨著肝損傷逐漸得到修復HSP60的應激保護作用逐漸下降。在整個肝損傷修復過程中，隨著損傷的加重或修復，HSP60的表達量也隨之同步變化呈正相關，說明HSP60可能參與了肝臟的損傷修復，可能體現(xiàn)在以下兩個方面［26］：抵抗損傷和加速修復。在創(chuàng)傷等應激原的作用下，細胞內產生變性或異常的蛋白質，表現(xiàn)為肽鏈伸展、失去盤旋及折疊狀態(tài)，分子空間構型的改變等，但此時HSP60發(fā)揮了分子伴侶作用，使蛋白質肽鏈重新折疊并恢復原來的構象及功能，從而在應激等不利狀態(tài)下提高細胞的抵抗力起到抗損傷作用；如果蛋白變性不可逆，HSP則幫助變性蛋白質轉入溶酶體加以清除，從而加速了組織的修復，因此表現(xiàn)為隨著肝損傷的加重或修復、HSP60的表達量隨之升高或降低?？傊琀SP60是保護細胞結構功能免受損傷所必需的，如何加強和利用HSP60的抗損傷和促進修復作用，則是今后的研究方向之一。

Neuritin（又稱 candidate plasticity-related gene 15，CPG15）［27］最初被認為是一條高度限制在神經系統(tǒng)表達的基因，它能促進神經突起的快速生長，后來的研究證實［28］Neuritin在肝組織中也有明顯表達，并且還介導了神經系統(tǒng)以外其他細胞的再生。實驗組在肝損傷后6、12、24、48 h，其血清ALT、AST不斷升高，病理組織顯示肝臟損傷程度不斷增加，表明肝損傷在逐漸加重，此時Neuritin的表達量逐漸下降，并且在第48小時肝損傷程度最重時，其表達量卻最低，可能是其對肝再生的作用逐漸減弱的表現(xiàn)。在肝損傷后3、7、14 d，其血清ALT、AST和病理組織顯示肝臟的損傷程度逐漸降低，表明肝損傷在逐漸修復，此時Neuritin的表達量卻逐漸上升，說明可能隨著肝損傷逐漸得到修復Neuritin對肝再生的作用逐漸增強。在整個肝損傷修復過程中，隨著肝損傷的加重或修復，Neuritin的表達量也呈現(xiàn)出一定變化規(guī)律呈負相關，說明Neuritin也可能參與了肝臟的損傷修復，但是具體分子機制目前國內外未見任何報道。我們推測：Neuritin作為神經營養(yǎng)因子，在肝臟組織中如同神經系統(tǒng)一樣，可能通過以下途徑促進肝損傷的再生修復：（1）Neuritin促進肝臟中神經再生：CPG15基因是神經活動和其他神經營養(yǎng)因子作用的下游基因［6，29-30］，提示Neuritin是神經活動和各種神經生長因子的下游因子，Neuritin可以促進神經突起的生長及其分支和突觸的發(fā)育成熟，調節(jié)突觸回路的形成［31］，而無論是神經活動的刺激還是神經生長因子的直接作用都能誘導神經突起的生長，而神經纖維的長入可影響肝損傷的再生修復；（2）Neuritin促進肝臟中血管再生：KOJIMA等［28］通過給予人臍靜脈內皮細胞重組的Neuritin，發(fā)現(xiàn)Neuritin能夠促進內皮細胞的遷移以及促進腫瘤組織中血管的生長，因而認為Neuritin可以被看做是一種血管生長因子，可增強血管內皮細胞的粘附和遷移能力，有利于新生毛細血管的生長，改善肝損傷后的血流動力學，促進肝損傷后的再生修復；（3）Neuritin與其他因子協(xié)同作用，具體有待于進一步研究。

STORTI等［32］研究發(fā)現(xiàn)，在應激作用下，熱休克反應（heat shock response，HSR）可抑制正常蛋白的合成，卻能使HSP大量表達并通過修復變性的蛋白而發(fā)揮對蛋白分子的應激保護作用。圖4表明，肝損傷后48 h內，隨著損傷的逐漸加重HSP60的表達量逐漸增加，而Neuritin的表達量卻逐漸下降，可能是HSR一方面抑制了Neuritin等重要蛋白的合成以減少應激對其所致的蛋白分子損傷；另一方面促進了HSP60的表達量增加，以促進HSP60對損傷的Neuritin等重要蛋白的修復。肝損傷48 h以后，隨著損傷因素的逐漸減弱，HSR也隨之逐漸降低，一方面HSR對Neuritin等重要蛋白的合成抑制作用逐漸減弱，從而使Neuritin的表達量逐漸升高，表現(xiàn)出Neuritin對肝臟的再生作用逐漸增強；另一方面，HSR促進HSP60合成的作用也逐漸減弱，從而使其表達量逐漸下降。進一步相關性分析顯示，在肝損傷修復的整個過程中，Neuritin與HSP60的表達變化趨勢截然相反，呈顯著的負相關性，該結果與STORTI等的結論相吻合，說明了兩者可能共同參與了肝損傷的再生修復。

因此，HSP60不僅降低了損傷因素帶來的傷害，即抵抗肝損傷；而且還促進了肝臟的再生修復，而Neuritin可能僅僅促進了肝損傷后的再生修復?；谏鲜鲅芯考敖湍鸽p雜交實驗［8］結果，我們大膽猜測：HSP60與Neuritin在肝損傷修復過程中可能功能相關，HSP60很可能作為Neuritin的上游因子通過某條信號通路發(fā)生相互作用而產生相應的生物效應，共同促進了肝損傷的再生修復，但具體信號通路及生物學機制有待于我們進一步深入研究，這也是本研究存在的局限性及不足之處，本課題組后續(xù)將進一步研究HSP60與Neuritin的關系及可能作用的信號通路，為研究肝損傷修復的發(fā)生發(fā)展提供新的實驗依據(jù)，為肝損傷的治療提供新的思路。

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