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        重組分泌型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體腺病毒對PC-3細(xì)胞荷瘤鼠瘤體的生長抑制

        2018-07-05 07:01:32高磊潘鐵軍謝鳴蔣淵喻希李想
        實用醫(yī)學(xué)雜志 2018年12期
        關(guān)鍵詞:前列腺癌實驗

        高磊 潘鐵軍 謝鳴 蔣淵 喻希 李想

        中國人民解放軍武漢總醫(yī)院泌尿外科(武漢 430070)

        腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)被發(fā)現(xiàn)后,經(jīng)過不斷研究證實其在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。TRAIL能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡,被認(rèn)為是一種很有前途的抗癌分子。我們前期成功構(gòu)建了表達(dá)分泌型TRAIL基因的腺病毒載體Ad-sTRAIL,并且在體外實驗中證實了Ad-sTRAIL可以抑制前列腺癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究試圖探討Ad-sTRAIL的體內(nèi)抗腫瘤作用。

        1 材料與方法

        1.1 材料與分組

        1.1.1 人前列腺癌細(xì)胞株 PC-3購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。Ad-LacZ病毒,Ad-sTRAIL病毒均由本科構(gòu)建保存。鼠抗人TRAIL單克隆抗體及兔抗鼠熒光素標(biāo)記二抗均購自Santa公司。新生牛血清購于北京四季青生物技術(shù)公司;RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco BRL公司)。DAPI染色液購于Beyotime公司。TUNEL檢測試劑盒購于Roche公司。本研究起止時間為2015年3月至2016年10月。

        1.1.2 分組 Control組:常規(guī)培養(yǎng)的PC-3細(xì)胞;Ad-LacZ組:40 MOI的Ad-LacZ感染的PC-3細(xì)胞;Ad-sTRAIL組:40 MOI的Ad-sTRAIL感染的PC-3細(xì)胞。

        1.2 方法

        1.2.1 DAPI染色檢測細(xì)胞凋亡 高壓消毒后無菌蓋玻片置于24孔板中,取細(xì)胞濃度5×105/mL,每孔300 μL,接種后每24小時分別以40 MOI的Ad-LacZ和Ad-sTRAIL感染相應(yīng)分組細(xì)胞,繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48 h。以4%多聚甲醛固定爬片,經(jīng)0.1%Triton PBS作用5 min,0.01 mol/L PBS溶液洗滌,滴加DAPI染液染色10 min,流水沖去染液,濾紙吸除多余水分,加一滴熒光封片液,熒光顯微鏡觀察并拍照。

        1.2.2 Transwell實驗 采用孔徑為8 μm的24孔Borden小室(美國BD公司)進(jìn)行實驗。先用無血清培養(yǎng)液沖洗小室上室2次,然后加入1∶8稀釋的Matrigel膠(美國BD公司)50 μL,37℃孵育30 min制作人工基底膜。以無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2 × 105個/mL,上室加入細(xì)胞懸液200 μL,下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液,37℃培養(yǎng)72 h后以Giemsa染色觀察穿入下室面的細(xì)胞數(shù)。

        1.2.3 體內(nèi)抗腫瘤實驗 PC-3細(xì)胞接種于雄性BALB/c裸鼠右側(cè)腋窩皮下(第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供)。待瘤塊長至足夠大時,取新鮮腫瘤組織在生理鹽水中剪成3 mm×3 mm×3 mm大小的小塊接種裸鼠右側(cè)背部,選取荷瘤成功的裸鼠18只;隨機(jī)分為3組,每組6只,分別為對照組、Ad-LacZ組和Ad-sTRAIL組。實驗開始后7、14 d給藥,共給藥2次。每3天測量1次瘤體的長徑(a)和短徑(b),按腫瘤體積V=a×b2/2。共觀察21 d,依據(jù)腫瘤體積計算腫瘤抑瘤率(%)=1-實驗組腫瘤體積/對照組腫瘤體積。

        1.2.4 荷瘤組織免疫組化 4%多聚甲醛固定,制作蠟塊、切片、貼片;用二甲苯浸洗2次,每次5 min;用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次,每次3 min。PBS清洗;加入0.3%的過氧化氫甲醇溶液30 min,PBS清洗5 min×3;0.3%Triton×100處理30 min,PBS清洗5 min×3。加入1∶500稀釋的鼠抗人TRAIL單克隆抗體,4℃存放24 h;吸去抗體,PBS清洗5 min×3。加入PBS稀釋的以生物素標(biāo)記的兔抗鼠二抗,室溫孵育2 h。PBS清洗5 min×3。加入ABC復(fù)合物,室溫孵育2 h,PBS清洗5 min×3;蒸餾水迅速沖3次。加入DAB顯色10 min,用蒸餾水迅速沖洗,蘇木素復(fù)染30 s;梯度酒精脫水之后,封片,拍照。

        1.2.5 荷瘤組織TUNEL染色 4%多聚甲醛固定,制作蠟塊、切片、貼片;用二甲苯及梯度乙醇;PBS漂洗3次;用Proteinase K工作液處理組織15 min在37℃;PBS漂洗3次;加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上,加蓋玻片反應(yīng)37℃×1 h。PBS漂洗3次;加50 μL converter-POD于標(biāo)本上,加蓋玻片反應(yīng)37℃×30 min。PBS漂洗3次;在組織處加100 μL DAB底物,反應(yīng)25℃×10 min;PBS漂洗3次;拍照后再用蘇木素復(fù)染30 s。梯度酒精脫水之后,封片,拍照。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果中定量數(shù)據(jù)用±s表示,均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 DAPI染色 Ad-sTRAIL組腫瘤細(xì)胞凋亡水平明顯高于Control組和Ad-LacZ組。Ad-sTRAIL組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)皺縮,胞漿致密,核染色質(zhì)邊集,并且胞核裂解,形成含核碎片和細(xì)胞器成份的凋亡小體(圖1)。

        2.2 TranswellAd-sTRAIL組穿入下室面的細(xì)胞數(shù)(24.8±3.70)明顯少于對照組(47.6±4.28,q=10.68,P<0.01)及Ad-LacZ組(49.6±4.39,q=11.61,P<0.01)。見圖2。

        2.3 體內(nèi)抗腫瘤實驗 與Control組和Ad-LacZ組的細(xì)胞相比,Ad-sTRAIL組的荷瘤鼠腫瘤生長能力顯著降低(圖3)。經(jīng)計算后可見Ad-sTRAIL對荷瘤鼠腫瘤的抑制率3 d為8.15%(P<0.05),6 d為11.55%(P<0.01),9 d為17.23%(P<0.01),12 d為20.05%(P<0.01),15 d為27.18%(P<0.01),18 d為34.27%(P<0.01),21 d為33.08%(P<0.01),隨時間抑制作用逐漸增強(qiáng)。

        圖1 Ad-sTRAIL對PC-3細(xì)胞凋亡的影響(×200)Fig.1 The effects of Ad-sTRAIL on PC-3 cells apoptosis(× 200)

        圖2 Ad-sTRAIL對PC-3細(xì)胞侵襲能力的影響(×200)Fig.2 The effects of Ad-sTRAIL on PC-3 cells invasion(× 200)

        圖3 Ad-sTRAIL對荷瘤鼠腫瘤增殖能力的影響Fig.3 The effects of Ad-sTRAIL on the tumor proliferation of tumor-bearing mice

        2.4 免疫組化實驗 Ad-sTRAIL組荷瘤鼠腫瘤組織中TRAIL表達(dá)水平明顯高于Control組和Ad-LacZ組(圖4)。TUNEL實驗顯示:Ad-sTRAIL組荷瘤鼠腫瘤細(xì)胞核染色明顯,表明該組細(xì)胞凋亡水平明顯高于Control組和Ad-LacZ組(圖5)。

        3 討論

        前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。在北美和歐洲國家中,前列腺癌為男性的第二大惡性腫瘤,在我國的發(fā)病率也有明顯增加的趨勢[1]。目前,對于伴發(fā)轉(zhuǎn)移的難治性前列腺癌主要的治療方法是化療。但由于前列腺癌屬于對化療不敏感的腫瘤,并常產(chǎn)生耐藥性,所以常規(guī)化療很難達(dá)到令人滿意的治療效果。隨著對腫瘤發(fā)病機(jī)制的不斷研究,基因治療已成為前列腺癌治療的重要方法[2]。

        TRAIL是腫瘤壞死因子家族的新成員,其可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡等,但對正常的細(xì)胞卻無影響[3]。有研究表明:TRAIL可以抑制人肺癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡;并且當(dāng)TRAIL與格列吡嗪聯(lián)合應(yīng)用時可以發(fā)揮更好的抗腫瘤效果[4]。同時,TRAIL在小細(xì)胞肺癌和肝癌中發(fā)揮重要作用,其主要是通過活化Caspase-8達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果。但TRAIL的促凋亡作用可被DNA損傷誘導(dǎo)凋亡抑制因子(DNA damage-induced apoptosis suppressor,DDIAS)減弱[5]。此外,TRAIL可與結(jié)腸癌細(xì)胞中的死亡受體結(jié)合,活化Fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas associated death domain protein,F(xiàn)ADD),從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。并且,TRAIL與熱休克蛋白90(heat shock protein 90,Hsp90)聯(lián)合應(yīng)用可以進(jìn)一步增強(qiáng)其促凋亡作用[6]。大量研究表明TRAIL可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[7]。作為腫瘤壞死因子家族TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體,TRAIL可與死亡受體(TRAIL-R1和TRAIL-R2)結(jié)合,激活Caspase信號通路,進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。TRAIL-R2在前列腺癌中高表達(dá),特別是晚期前列腺癌[8]。因此前列腺癌細(xì)胞對TRAIL反應(yīng)敏感,所以構(gòu)建表達(dá)TRAIL的腺病毒用于治療前列腺癌存在理論基礎(chǔ)[9]。本研究成功構(gòu)建了表達(dá)分泌型TRAIL基因的腺病毒載體Ad-sTRAIL;并以該載體感染前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3,結(jié)果表明經(jīng)Ad-sTRAIL感染組腫瘤細(xì)胞凋亡水平明顯增加;同時Ad-sTRAIL還抑制了PC3細(xì)胞的侵襲能力。TRAIL蛋白表達(dá)水平增加導(dǎo)致其與死亡受體結(jié)合增加,誘導(dǎo)胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域變構(gòu),從而催化裂解Caspase-8前體,激活形成活化型Caspase-8,進(jìn)一步放大凋亡信號以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。進(jìn)一步的實驗也驗證了這一結(jié)論,DAPI染色顯示Ad-sTRAIL感染前列腺癌細(xì)胞后,腫瘤細(xì)胞凋亡水平顯著提升,出現(xiàn)皺縮,胞漿致密,核染色質(zhì)邊集,并且胞核裂解,形成含核碎片和細(xì)胞器成份的凋亡小體。另外,Transwell試驗結(jié)果顯示Ad-sTRAIL感染后細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力明顯降低。進(jìn)一步荷瘤鼠實驗表明,Ad-sTRAIL組的荷瘤鼠腫瘤生長能力顯著降低,證明Ad-sTRAIL在體內(nèi)亦能發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。免疫組化實驗及TUNEL實驗證實,荷瘤鼠腫瘤組織中TRAIL表達(dá)水平的增加導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞凋亡水平的增加。

        圖4 TRAIL蛋白在3組荷瘤鼠腫瘤組織中的表達(dá)(×200)Fig.4 The expression of TRAIL protein in tumors of three groups tumor-bearing mice(× 200)

        圖5 Ad-sTRAIL對3組荷瘤鼠腫瘤細(xì)胞凋亡的影響(×200)Fig.5 The effects of Ad-sTRAIL on tumor cells apoptosis of three groups tumor-bearing mice(× 200)

        綜上所述,通過提高TRAIL的表達(dá)在體內(nèi)外均可以抑制PC-3細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡;其具體機(jī)制可能是通過增加前列腺癌細(xì)胞中TRAIL的表達(dá)來活化Caspase-3和Caspase-8達(dá)到促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡的作用。本研究成功在體內(nèi)實驗中驗證了Ad-sTRAIL抗腫瘤效果,為下一步的臨床抗腫瘤研究奠定了基礎(chǔ)。

        [1]韓蘇軍,張思維,陳萬青,等.中國前列腺癌發(fā)病現(xiàn)狀和流行趨勢分析[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2013,18(4):330-334.

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