程坦 鄭杰靈 劉穎 謝國柱 袁亞維

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科（廣州510515）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）是鼻咽部起源的最常見的惡性腫瘤，好發(fā)于中國東南部、東南亞地區(qū)，并以廣東最為高發(fā)［1］。目前，放射治療（放療）或以放療為主的綜合治療是鼻咽癌的主要治療手段。雖然初診未轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者綜合治療后5年生存率已接近85%左右，但仍有部分患者因局部復(fù)發(fā)或腫瘤轉(zhuǎn)移未能獲得長期生存［2-3］。包括鼻咽癌在內(nèi)的大多數(shù)實(shí)體瘤中廣泛存在乏氧，乏氧也被公認(rèn)為是腫瘤對(duì)包括放療在內(nèi)的多種治療手段抵抗的重要原因。因此，改善腫瘤組織內(nèi)乏氧的腫瘤細(xì)胞的放射抵抗對(duì)提高鼻咽癌患者的放療療效具有重要的意義［4-5］。腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下，仍然主要通過糖酵解獲取能量［6］。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）是催化腫瘤細(xì)胞胞漿中乳酸生成的糖酵解的關(guān)鍵酶之一。以往研究表明LDH-A抑制劑草氨酸鈉對(duì)體外常氧培養(yǎng)的胃癌、肺癌細(xì)胞有一定的生長抑制作用。但草氨酸鈉對(duì)乏氧鼻咽癌細(xì)胞的增殖以及放射敏感性的影響卻罕見報(bào)道。在此筆者使用草氨酸鈉干預(yù)體外乏氧培養(yǎng)的人鼻咽癌細(xì)胞CNE2，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、放射敏感性的影響，初步探討其潛在機(jī)制，為進(jìn)一步的體內(nèi)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 顯微鏡（日本Olympus公司）；人鼻咽癌細(xì)胞CNE2為南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科實(shí)驗(yàn)室凍存；RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶（美國Gibco公司）；南美胎牛血清（美國Gibco公司）；PBS溶液（美國Hyclone公司）；100X青鏈霉素溶液（美國Gibco公司）；草氨酸鈉（上海麥克林生化科技有限公司），純度＞98%；乳酸測定試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；人血管緊張素ⅡELISA試劑盒（美國Ray Biotech公司）；DMSO、MTT粉劑（美國Sigma公司）；酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人鼻咽癌CNE2細(xì)胞株采用含10%胎牛血清RMPI-1640培養(yǎng)液置5%CO2，37℃孵箱培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期用PBS溶液清洗2次，然后0.25%胰酶消化，終止消化后反復(fù)吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后平鋪置96孔板、6孔板或培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)準(zhǔn)備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞乏氧時(shí)，將貼壁后的細(xì)胞置于充滿5%CO2、95%N2混合氣體，O2濃度維持在1%的37℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞內(nèi)乳酸含量測定 向常氧、乏氧條件下培養(yǎng)的已貼壁的CNE2鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入草氨酸鈉溶液（草氨酸鈉終濃度為20 mmol/L），對(duì)照組加入等體積的PBS。培養(yǎng)48 h后吸去培養(yǎng)基，用PBS液清洗2次，然后用0.25%胰酶消化，終止消化后1 000 r/min離心5 min得沉淀的細(xì)胞。用PBS重懸清洗細(xì)胞后再次離心，向裝有細(xì)胞的EP管中加入已預(yù)冷的生理鹽水并置于冰上勻漿。將制備好的勻漿4℃3 000 r/min離心15 min，吸取上清并按乳酸測定試劑盒說明書要求操作測定乳酸含量。

1.2.3 上清中血管緊張素Ⅱ含量測定 在24孔板內(nèi)接種2×105個(gè)/孔狀態(tài)良好的腫瘤細(xì)胞，并加入1 mL培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別接受20 mmol/L和等體積PBS處理，乏氧培養(yǎng)24 h后吸取培養(yǎng)基上清至離心管內(nèi)，按照血管緊張素Ⅱ檢測試劑盒說明書步驟測定上清中血管緊張素Ⅱ含量。

1.2.4 四氮噻唑藍(lán)（MTT）實(shí)驗(yàn) 接種于96孔板的細(xì)胞乏氧條件培養(yǎng)12 h后分別加入經(jīng)培基稀釋的不同濃度草氨酸鈉（終濃度分別為30、60、90 mmol/L），同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（加入等體積的培養(yǎng)液），各組均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，置孵箱中繼續(xù)乏氧培養(yǎng)，藥物作用24、48、72 h后，取出相應(yīng)的96孔板每孔分別加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄各孔液體，每孔加入150 μL DMSO，振蕩待藍(lán)色晶體溶解后酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測每孔的吸光度（A490）值，確定藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率。計(jì)算細(xì)胞生長抑制率：細(xì)胞生長抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.2.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)（colony formation assay）檢測細(xì)胞的放射敏感性［7］用0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長期的CNE2鼻咽癌細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以每孔200、400、2 000、4 000、和10 000個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中，每個(gè)劑量接種3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，草氨酸鈉組和對(duì)照組分別用20 mmol/L草氨酸鈉溶液和PBS液繼續(xù)培養(yǎng)24 h并給予0、2、4、6、8 Gy的6 MV X線滿射野照射。照射后繼續(xù)培養(yǎng)9 d，取出培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)液，用1XPBS清洗2次，甲醛固定15 min。棄去固定液并用0.1%結(jié)晶紫染色并在顯微鏡下技術(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆。以0 Gy組克隆形成率為對(duì)照，計(jì)算出各個(gè)劑量組的細(xì)胞存活率?？寺⌒纬陕剩≒E）=對(duì)照組克隆數(shù)（0 Gy組克隆數(shù)）/接種細(xì)胞數(shù)×100%，存活分?jǐn)?shù)（SF）=實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/（接種細(xì)胞數(shù)×PE）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組樣本的比較采用單向方差分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 草氨酸鈉抑制CNE2細(xì)胞乳酸的生成 細(xì)胞內(nèi)乳酸水平檢測結(jié)果顯示，即使在常氧條件下，CNE2細(xì)胞內(nèi)也有較多的乳酸積累，乏氧條件下乳酸水平進(jìn)一步提升。加入草氨酸鈉處理后，兩種條件下的CNE2細(xì)胞乳酸水平均顯著降低。見圖1。

圖1 草氨酸鈉處理對(duì)CNE2細(xì)胞乳酸含量的影響Fig.1 Effect of sodium oxalate on the production of lactate in CNE2 cells

2.2 草氨酸鈉抑制腫瘤細(xì)胞血管緊張素的生成常氧條件下，CNE2細(xì)胞僅產(chǎn)生少量的血管緊張素Ⅱ，乏氧條件下CNE2細(xì)胞上清血管緊張素Ⅱ含量明顯增多。20 mmol/L草氨酸鈉處理可減少兩種條件下腫瘤細(xì)胞血管緊張素Ⅱ的分泌。見圖2。

2.3 草氨酸氨對(duì)乏氧CNE2細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT檢測結(jié)果顯示，經(jīng)30、60、90 mmol/L不同濃度草氨酸鈉處理不同時(shí)間對(duì)乏氧CNE2細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，且呈現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴性（表1），與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖2 草氨酸鈉處理對(duì)CNE2細(xì)胞上清血管緊張素Ⅱ含量的影響Fig.2 Effect of sodium oxalate on the production of angiotensinⅡin CNE2 cells

表1 不同濃度草氨酸鈉與不同作用時(shí)間對(duì)乏氧CNE2細(xì)胞增殖的抑制率Tab.1 Inhibitory rate of sodium oxalate on proliferation in hypoxic CNE2 cells ± s，%

表1 不同濃度草氨酸鈉與不同作用時(shí)間對(duì)乏氧CNE2細(xì)胞增殖的抑制率Tab.1 Inhibitory rate of sodium oxalate on proliferation in hypoxic CNE2 cells ± s，%

草氨酸鈉濃度（mmol/L）30 60 90作用時(shí)間24 h 2.68±0.59 13.83±3.21 30.61±5.46 48 h 11.45±2.44 23.97±5.54 47.99±10.26 72 h 15.97±4.21 32.50±4.67 59.75±9.73

2.4 草氨酸鈉增加了乏氧腫瘤細(xì)胞的放射敏感性 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，草氨酸鈉降低了乏氧條件下培養(yǎng)的CNE2細(xì)胞經(jīng)不同劑量照射后的存活分?jǐn)?shù)（survival fraction，SF）（圖3），提高了乏氧CNE2細(xì)胞的放射敏感性。

圖3 草氨酸鈉對(duì)乏氧CNE2細(xì)胞放射敏感性的影響Fig.3 Effect of sodium oxalate on the radiosensitivity of hypoxic CNE2 cells

3 討論

近年來，隨著放射生物學(xué)，尤其是放射物理學(xué)的快速發(fā)展，鼻咽癌放療臨床獲益顯著，但仍有部分患者因局部區(qū)域腫瘤的復(fù)發(fā)和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療失敗。造成這一局面的重要原因是腫瘤細(xì)胞的放射生物學(xué)抵抗［8］。同其他實(shí)體瘤一樣，鼻咽癌也存在瘤內(nèi)的乏氧，與普通細(xì)胞相比乏氧的腫瘤細(xì)胞對(duì)射線有更強(qiáng)的抵抗力，在放療中這部分細(xì)胞不易被殺死，成為治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛在根源［9］。因此克服乏氧腫瘤細(xì)胞放射抵抗仍然是目前惡性腫瘤放射治療面臨的重要挑戰(zhàn)。

能量代謝異常是惡性腫瘤最鮮明的特征之一，雖然與氧化磷酸化相比糖酵解是一種低效的能量代謝方式，但是腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下仍活躍地?cái)z取葡萄糖進(jìn)行糖酵解來供應(yīng)能量。腫瘤細(xì)胞的這種能量代謝方式被稱作“有氧糖酵解”或“Warburg效應(yīng)”［6］。LDH是調(diào)節(jié)糖酵解的重要酶之一，在胞漿內(nèi)催化糖酵解途徑的產(chǎn)物丙酮酸生成乳酸完成糖酵解全過程。草氨酸鈉（sodium oxamate）是LDH-A（LDH的5種同工酶之一）的特異性抑制劑，可抑制癌細(xì)胞糖酵解的發(fā)生，阻斷癌細(xì)胞的能量供應(yīng)來源［10］。YAND等［11］在人肺腺癌H1395中發(fā)現(xiàn)草氨酸鈉可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并引起G2/M期阻滯。LIU等［12］使用草氨酸鈉處理胃癌SGC-7901細(xì)胞和BGC-823細(xì)胞發(fā)現(xiàn)可抑制其增殖并降低細(xì)胞的侵襲性，誘導(dǎo)它們發(fā)生凋亡。ZHAO等［13］也在胃癌細(xì)胞中得到了相一致的結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)草氨酸鈉可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬。

在此，本課題組研究了草氨酸鈉對(duì)乏氧鼻咽癌細(xì)胞CNE2體外增殖和放射敏感性的影響，及其潛在機(jī)制。結(jié)果顯示，由于“Warburg效應(yīng)”的存在，鼻咽癌細(xì)胞CNE2即使在常氧條件下仍有較多的乳酸生成，乏氧條件下乳酸的產(chǎn)生進(jìn)一步增多。草氨酸鈉在兩種條件下均能夠顯著抑制乳酸的生成。相似地，在乏氧鼻咽癌細(xì)胞CNE2中，草氨酸鈉也可呈時(shí)間和劑量依賴性抑制其增殖。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）在腫瘤生物學(xué)中發(fā)揮著重要作用［14］，近年來的研究顯示其參與了腫瘤的化學(xué)治療、免疫治療抵抗［15-16］。血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）被認(rèn)為是RAS最主要的生物活性物質(zhì)。本課題組之前的研究顯示乏氧腫瘤中AngⅡ水平明顯升高，血管緊張素Ⅱ受體1型（AngiotensinⅡreceptor type 1，AT1R）信號(hào)阻斷可提高乏氧鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性［17-19］。為研究草氨酸鈉對(duì)乏氧鼻咽癌細(xì)胞AngⅡ水平的影響，筆者檢測了CNE2上清中AngⅡ的含量發(fā)現(xiàn)無論常氧還是乏氧條件下草氨酸鈉均可抑制鼻咽癌細(xì)胞AngⅡ的生成?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)證實(shí)了草氨酸鈉可顯著提高乏氧鼻咽癌細(xì)胞CNE2的放射敏感性，因此筆者推測，其抑制AngⅡ的生成，下調(diào)AT1R信號(hào)可能是草氨酸鈉放射增敏效應(yīng)的機(jī)制之一，但仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

草氨酸鈉因其對(duì)正常組織細(xì)胞的毒性較低，作為新型放射增敏劑具有廣闊的應(yīng)用前景。筆者將繼續(xù)深入研究草氨酸鈉抑制乏氧腫瘤細(xì)胞AngⅡ生成，增強(qiáng)放射敏感性的分子機(jī)制并為動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)?？傊?，本研究為理解乏氧腫瘤細(xì)胞放射抵抗的機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)，同時(shí)為克服鼻咽癌放療抵抗從而減少放療后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供了新的潛在策略與手段。

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