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        草氨酸鈉抑制乏氧鼻咽癌細(xì)胞CNE2血管緊張素Ⅱ生成提高放射敏感性

        2018-07-05 07:01:28程坦鄭杰靈劉穎謝國柱袁亞維
        實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2018年12期

        程坦 鄭杰靈 劉穎 謝國柱 袁亞維

        南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科(廣州510515)

        鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)是鼻咽部起源的最常見的惡性腫瘤,好發(fā)于中國東南部、東南亞地區(qū),并以廣東最為高發(fā)[1]。目前,放射治療(放療)或以放療為主的綜合治療是鼻咽癌的主要治療手段。雖然初診未轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者綜合治療后5年生存率已接近85%左右,但仍有部分患者因局部復(fù)發(fā)或腫瘤轉(zhuǎn)移未能獲得長期生存[2-3]。包括鼻咽癌在內(nèi)的大多數(shù)實(shí)體瘤中廣泛存在乏氧,乏氧也被公認(rèn)為是腫瘤對(duì)包括放療在內(nèi)的多種治療手段抵抗的重要原因。因此,改善腫瘤組織內(nèi)乏氧的腫瘤細(xì)胞的放射抵抗對(duì)提高鼻咽癌患者的放療療效具有重要的意義[4-5]。腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下,仍然主要通過糖酵解獲取能量[6]。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)是催化腫瘤細(xì)胞胞漿中乳酸生成的糖酵解的關(guān)鍵酶之一。以往研究表明LDH-A抑制劑草氨酸鈉對(duì)體外常氧培養(yǎng)的胃癌、肺癌細(xì)胞有一定的生長抑制作用。但草氨酸鈉對(duì)乏氧鼻咽癌細(xì)胞的增殖以及放射敏感性的影響卻罕見報(bào)道。在此筆者使用草氨酸鈉干預(yù)體外乏氧培養(yǎng)的人鼻咽癌細(xì)胞CNE2,觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、放射敏感性的影響,初步探討其潛在機(jī)制,為進(jìn)一步的體內(nèi)研究奠定了基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑與儀器 顯微鏡(日本Olympus公司);人鼻咽癌細(xì)胞CNE2為南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科實(shí)驗(yàn)室凍存;RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶(美國Gibco公司);南美胎牛血清(美國Gibco公司);PBS溶液(美國Hyclone公司);100X青鏈霉素溶液(美國Gibco公司);草氨酸鈉(上海麥克林生化科技有限公司),純度>98%;乳酸測定試劑盒(南京建成生物科技有限公司);人血管緊張素ⅡELISA試劑盒(美國Ray Biotech公司);DMSO、MTT粉劑(美國Sigma公司);酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人鼻咽癌CNE2細(xì)胞株采用含10%胎牛血清RMPI-1640培養(yǎng)液置5%CO2,37℃孵箱培養(yǎng),待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期用PBS溶液清洗2次,然后0.25%胰酶消化,終止消化后反復(fù)吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后平鋪置96孔板、6孔板或培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)準(zhǔn)備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞乏氧時(shí),將貼壁后的細(xì)胞置于充滿5%CO2、95%N2混合氣體,O2濃度維持在1%的37℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

        1.2.2 細(xì)胞內(nèi)乳酸含量測定 向常氧、乏氧條件下培養(yǎng)的已貼壁的CNE2鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入草氨酸鈉溶液(草氨酸鈉終濃度為20 mmol/L),對(duì)照組加入等體積的PBS。培養(yǎng)48 h后吸去培養(yǎng)基,用PBS液清洗2次,然后用0.25%胰酶消化,終止消化后1 000 r/min離心5 min得沉淀的細(xì)胞。用PBS重懸清洗細(xì)胞后再次離心,向裝有細(xì)胞的EP管中加入已預(yù)冷的生理鹽水并置于冰上勻漿。將制備好的勻漿4℃3 000 r/min離心15 min,吸取上清并按乳酸測定試劑盒說明書要求操作測定乳酸含量。

        1.2.3 上清中血管緊張素Ⅱ含量測定 在24孔板內(nèi)接種2×105個(gè)/孔狀態(tài)良好的腫瘤細(xì)胞,并加入1 mL培養(yǎng)基,待細(xì)胞貼壁后,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別接受20 mmol/L和等體積PBS處理,乏氧培養(yǎng)24 h后吸取培養(yǎng)基上清至離心管內(nèi),按照血管緊張素Ⅱ檢測試劑盒說明書步驟測定上清中血管緊張素Ⅱ含量。

        1.2.4 四氮噻唑藍(lán)(MTT)實(shí)驗(yàn) 接種于96孔板的細(xì)胞乏氧條件培養(yǎng)12 h后分別加入經(jīng)培基稀釋的不同濃度草氨酸鈉(終濃度分別為30、60、90 mmol/L),同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(加入等體積的培養(yǎng)液),各組均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,置孵箱中繼續(xù)乏氧培養(yǎng),藥物作用24、48、72 h后,取出相應(yīng)的96孔板每孔分別加入5 mg/mL的MTT 20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄各孔液體,每孔加入150 μL DMSO,振蕩待藍(lán)色晶體溶解后酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測每孔的吸光度(A490)值,確定藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率。計(jì)算細(xì)胞生長抑制率:細(xì)胞生長抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

        1.2.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)(colony formation assay)檢測細(xì)胞的放射敏感性[7]用0.25%胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長期的CNE2鼻咽癌細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,以每孔200、400、2 000、4 000、和10 000個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中,每個(gè)劑量接種3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后,草氨酸鈉組和對(duì)照組分別用20 mmol/L草氨酸鈉溶液和PBS液繼續(xù)培養(yǎng)24 h并給予0、2、4、6、8 Gy的6 MV X線滿射野照射。照射后繼續(xù)培養(yǎng)9 d,取出培養(yǎng)皿,棄去培養(yǎng)液,用1XPBS清洗2次,甲醛固定15 min。棄去固定液并用0.1%結(jié)晶紫染色并在顯微鏡下技術(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆。以0 Gy組克隆形成率為對(duì)照,計(jì)算出各個(gè)劑量組的細(xì)胞存活率??寺⌒纬陕剩≒E)=對(duì)照組克隆數(shù)(0 Gy組克隆數(shù))/接種細(xì)胞數(shù)×100%,存活分?jǐn)?shù)(SF)=實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/(接種細(xì)胞數(shù)×PE)。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組樣本的比較采用單向方差分析,當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 草氨酸鈉抑制CNE2細(xì)胞乳酸的生成 細(xì)胞內(nèi)乳酸水平檢測結(jié)果顯示,即使在常氧條件下,CNE2細(xì)胞內(nèi)也有較多的乳酸積累,乏氧條件下乳酸水平進(jìn)一步提升。加入草氨酸鈉處理后,兩種條件下的CNE2細(xì)胞乳酸水平均顯著降低。見圖1。

        圖1 草氨酸鈉處理對(duì)CNE2細(xì)胞乳酸含量的影響Fig.1 Effect of sodium oxalate on the production of lactate in CNE2 cells

        2.2 草氨酸鈉抑制腫瘤細(xì)胞血管緊張素的生成常氧條件下,CNE2細(xì)胞僅產(chǎn)生少量的血管緊張素Ⅱ,乏氧條件下CNE2細(xì)胞上清血管緊張素Ⅱ含量明顯增多。20 mmol/L草氨酸鈉處理可減少兩種條件下腫瘤細(xì)胞血管緊張素Ⅱ的分泌。見圖2。

        2.3 草氨酸氨對(duì)乏氧CNE2細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT檢測結(jié)果顯示,經(jīng)30、60、90 mmol/L不同濃度草氨酸鈉處理不同時(shí)間對(duì)乏氧CNE2細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用,且呈現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴性(表1),與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。

        圖2 草氨酸鈉處理對(duì)CNE2細(xì)胞上清血管緊張素Ⅱ含量的影響Fig.2 Effect of sodium oxalate on the production of angiotensinⅡin CNE2 cells

        表1 不同濃度草氨酸鈉與不同作用時(shí)間對(duì)乏氧CNE2細(xì)胞增殖的抑制率Tab.1 Inhibitory rate of sodium oxalate on proliferation in hypoxic CNE2 cells ± s,%

        表1 不同濃度草氨酸鈉與不同作用時(shí)間對(duì)乏氧CNE2細(xì)胞增殖的抑制率Tab.1 Inhibitory rate of sodium oxalate on proliferation in hypoxic CNE2 cells ± s,%

        草氨酸鈉濃度(mmol/L)30 60 90作用時(shí)間24 h 2.68±0.59 13.83±3.21 30.61±5.46 48 h 11.45±2.44 23.97±5.54 47.99±10.26 72 h 15.97±4.21 32.50±4.67 59.75±9.73

        2.4 草氨酸鈉增加了乏氧腫瘤細(xì)胞的放射敏感性 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,草氨酸鈉降低了乏氧條件下培養(yǎng)的CNE2細(xì)胞經(jīng)不同劑量照射后的存活分?jǐn)?shù)(survival fraction,SF)(圖3),提高了乏氧CNE2細(xì)胞的放射敏感性。

        圖3 草氨酸鈉對(duì)乏氧CNE2細(xì)胞放射敏感性的影響Fig.3 Effect of sodium oxalate on the radiosensitivity of hypoxic CNE2 cells

        3 討論

        近年來,隨著放射生物學(xué),尤其是放射物理學(xué)的快速發(fā)展,鼻咽癌放療臨床獲益顯著,但仍有部分患者因局部區(qū)域腫瘤的復(fù)發(fā)和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療失敗。造成這一局面的重要原因是腫瘤細(xì)胞的放射生物學(xué)抵抗[8]。同其他實(shí)體瘤一樣,鼻咽癌也存在瘤內(nèi)的乏氧,與普通細(xì)胞相比乏氧的腫瘤細(xì)胞對(duì)射線有更強(qiáng)的抵抗力,在放療中這部分細(xì)胞不易被殺死,成為治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛在根源[9]。因此克服乏氧腫瘤細(xì)胞放射抵抗仍然是目前惡性腫瘤放射治療面臨的重要挑戰(zhàn)。

        能量代謝異常是惡性腫瘤最鮮明的特征之一,雖然與氧化磷酸化相比糖酵解是一種低效的能量代謝方式,但是腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下仍活躍地?cái)z取葡萄糖進(jìn)行糖酵解來供應(yīng)能量。腫瘤細(xì)胞的這種能量代謝方式被稱作“有氧糖酵解”或“Warburg效應(yīng)”[6]。LDH是調(diào)節(jié)糖酵解的重要酶之一,在胞漿內(nèi)催化糖酵解途徑的產(chǎn)物丙酮酸生成乳酸完成糖酵解全過程。草氨酸鈉(sodium oxamate)是LDH-A(LDH的5種同工酶之一)的特異性抑制劑,可抑制癌細(xì)胞糖酵解的發(fā)生,阻斷癌細(xì)胞的能量供應(yīng)來源[10]。YAND等[11]在人肺腺癌H1395中發(fā)現(xiàn)草氨酸鈉可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并引起G2/M期阻滯。LIU等[12]使用草氨酸鈉處理胃癌SGC-7901細(xì)胞和BGC-823細(xì)胞發(fā)現(xiàn)可抑制其增殖并降低細(xì)胞的侵襲性,誘導(dǎo)它們發(fā)生凋亡。ZHAO等[13]也在胃癌細(xì)胞中得到了相一致的結(jié)果,并發(fā)現(xiàn)草氨酸鈉可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬。

        在此,本課題組研究了草氨酸鈉對(duì)乏氧鼻咽癌細(xì)胞CNE2體外增殖和放射敏感性的影響,及其潛在機(jī)制。結(jié)果顯示,由于“Warburg效應(yīng)”的存在,鼻咽癌細(xì)胞CNE2即使在常氧條件下仍有較多的乳酸生成,乏氧條件下乳酸的產(chǎn)生進(jìn)一步增多。草氨酸鈉在兩種條件下均能夠顯著抑制乳酸的生成。相似地,在乏氧鼻咽癌細(xì)胞CNE2中,草氨酸鈉也可呈時(shí)間和劑量依賴性抑制其增殖。

        腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)在腫瘤生物學(xué)中發(fā)揮著重要作用[14],近年來的研究顯示其參與了腫瘤的化學(xué)治療、免疫治療抵抗[15-16]。血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)被認(rèn)為是RAS最主要的生物活性物質(zhì)。本課題組之前的研究顯示乏氧腫瘤中AngⅡ水平明顯升高,血管緊張素Ⅱ受體1型(AngiotensinⅡreceptor type 1,AT1R)信號(hào)阻斷可提高乏氧鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性[17-19]。為研究草氨酸鈉對(duì)乏氧鼻咽癌細(xì)胞AngⅡ水平的影響,筆者檢測了CNE2上清中AngⅡ的含量發(fā)現(xiàn)無論常氧還是乏氧條件下草氨酸鈉均可抑制鼻咽癌細(xì)胞AngⅡ的生成??寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)證實(shí)了草氨酸鈉可顯著提高乏氧鼻咽癌細(xì)胞CNE2的放射敏感性,因此筆者推測,其抑制AngⅡ的生成,下調(diào)AT1R信號(hào)可能是草氨酸鈉放射增敏效應(yīng)的機(jī)制之一,但仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

        草氨酸鈉因其對(duì)正常組織細(xì)胞的毒性較低,作為新型放射增敏劑具有廣闊的應(yīng)用前景。筆者將繼續(xù)深入研究草氨酸鈉抑制乏氧腫瘤細(xì)胞AngⅡ生成,增強(qiáng)放射敏感性的分子機(jī)制并為動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)??傊?,本研究為理解乏氧腫瘤細(xì)胞放射抵抗的機(jī)制提供了一定的理論依據(jù),同時(shí)為克服鼻咽癌放療抵抗從而減少放療后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供了新的潛在策略與手段。

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