牛夢鴿 謝雄雄 王超鵬 周美娟

南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院放射醫(yī)學系，廣東省熱帶病研究重點實驗室（廣州 510515）

隨著對環(huán)境污染關注，大氣顆粒物（particulate matter，PM）已經(jīng)成為環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測的重要指標。由于PM2.5粒徑小，表面積相對大，因而更容易富集環(huán)境中存在的金屬離子、細菌、病毒、有機物質(zhì)以及酸性氧化物等，并對人體健康造成不良影響［1］。已有相關文獻報道暴露于PM2.5可以引起特異性皮炎、痤瘡、濕疹等炎癥性皮膚疾病以及促進皮膚老化［2-4］，但具體發(fā)生機制還不明確。國內(nèi)外研究證明PM2.5可以通過氧化應激產(chǎn)生炎癥因子［5-6］，進而引起細胞凋亡或者自噬。日光中的紫外線，尤其是中波紫外線（UVB），是造成人體皮膚損害最常見的環(huán)境因素之一，角質(zhì)形成細胞是皮膚表皮的重要組成部分，占表皮細胞的90%，是UVB輻射的主要靶細胞。UVB作用角質(zhì)形成細胞，可通過氧化應激，DNA損傷等引起其輻射損傷［7-9］，甚至誘發(fā)皮膚癌［10］。暴露于外界環(huán)境中的人體皮膚是極易受到上述兩種環(huán)境致傷因素的聯(lián)合作用，但目前二者聯(lián)合處理后對皮膚細胞的影響尚不清楚，本研究基于此，嘗試性探討了PM2.5聯(lián)合UVB處理對人皮膚角質(zhì)形成細胞HaCaT的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人表皮角質(zhì)形成細胞HaCaT，購自武漢大學生命科學院中國典型培養(yǎng)物保藏中心。DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），0.25%Trypsin-EDTA（美國Gibco公司），新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），DMSO（廣東光華科技股份有限公司），Annexin V雙標凋亡檢測試劑盒（北京全式金生物公司），紫外照射源（上海顧村光電儀器廠），超聲清洗器（DL-720A），冷凍真空干燥機（CHRIST 1-2LD plus），流式細胞儀器（FACS），電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（X SeriesⅡ）。

1.2 細胞培養(yǎng) 人表皮角質(zhì)形成細胞HaCaT，在5%CO2，37℃條件下，用含體積分數(shù)為10%的小牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 處理方法

1.3.1 PM2.5懸液制備及成分分析 PM2.5采樣濾膜來自2016年11月23日廣州地區(qū)采集72 h的樣品。將采樣濾膜剪成1 cm×4 cm大小，浸入50 mL超純水中，超聲處理1 h，用潔凈扁圓頭鑷子單向反復輕刮擦濾膜表面，至濾膜由黑色轉(zhuǎn)變?yōu)闇\白色，制備成懸液，懸液經(jīng)6～8層紗布過濾后分裝于玻璃瓶中置于-80℃冰箱過夜。樣品置于真空冷凍干燥器進行冷凍干燥處理，待其水分蒸發(fā)后可得干燥灰色絮狀物，稱重容器內(nèi)獲取的絮狀物重量，加入相應體積的PBS配制成終濃度為5 mg/mL的PM2.5儲備液，高壓滅菌后-20℃保存，使用時用完全培養(yǎng)基配制成相應的濃度。

1.3.2 細胞分組與處理 將細胞分為空白對照組（NC組）、單純IC50濃度的PM2.5處理組（PM2.5組）、單純30 mJ/cm2的UVB照射組（UVB組）和PM2.5聯(lián)合UVB處理組（聯(lián)合處理組）。將HaCaT細胞消化后制成105個/mL細胞懸液，并按一定細胞數(shù)量分別接種于96孔板、6 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h后，各組分別用PBS清洗3次后進行相應處理。UVB組和聯(lián)合處理組置于距離UVB紫外光輻射源（光源波長為305 nm，功率密度0.165 mW/cm2，輻照劑量=輻射密度×輻射時間）40 cm的紫外光源箱體指定位置，累計照射劑量達30 mJ/cm2，對照組和PM2.5組給予同等條件下假照射，即除不照射UVB外，其余處理過程均與UVB組和聯(lián)合處理組一致。照射完畢后對照組和UVB組分別加入完全培養(yǎng)基，PM2.5組和聯(lián)合處理組分別加入含PM2.5質(zhì)量濃度為300 μg/mL的完全培養(yǎng)基，所有組別細胞處理完畢后均置于5%CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞，進行后續(xù)實驗。

1.3.3 MTT法檢測 取對數(shù)生長期的細胞，消化離心收集后，調(diào)整細胞懸液濃度為1×105個/mL，接種于96孔板中，每孔加入100 μL，將96孔板置于5%CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的PM2.5懸液，終濃度為5、10、25、50、100、200、400 μg/mL，每個濃度設5個復孔。染毒24 h后棄上清，清洗3次后每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入150 μL DMSO，在酶聯(lián)免疫檢測儀振蕩10 min，測量OD570nm處各孔的吸光值；細胞存活率=（檢測組OD-空白孔OD）/（對照組OD-空白孔OD）×100%。實驗重復3次。

1.3.4 流式細胞術測細胞凋亡 細胞完成處理后收集細胞，加入50 μL預冷的1×Annexin V Binding Buffer重懸細胞，加入2.5 μL Annexin V-FITC 和2.5 μLPI，輕輕混勻，室溫避光反應 15 min，加入200 μL預冷的1×Annexin V Binding Buffer，輕輕混勻，冰上避光放置，1 h內(nèi)流式細胞儀上機檢測。實驗重復3次。

1.3.5 蛋白免疫印跡實驗 細胞接受各處理24 h后收集細胞提取蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗（1∶5 000）后4℃孵育過夜，TBST漂洗三次后加入相應的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，最后經(jīng)ECL化學發(fā)光法顯色。實驗重復3次。

1.4 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。定量資料經(jīng)檢驗服從正態(tài)分布采用均數(shù)±標準差進行描述，多個樣本進行比較采用單因素方差分析，方差齊性時采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett-T3法。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5樣品金屬成分鑒定 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀檢測樣品中金屬所占含量由多到少依次為：Ca、Zn、Ba、Al、Mg、Cu、Pb、Mn，其余測出的金屬含量均低于0.50 mg/L，故未列出（表1）。

表1 在PM2.5樣品中檢測金屬成分含量Tab.1 Detection of metal components in the sample PM2.5

2.2 不同濃度（0、5、10、25、50、100、200、400 μg/mL）的PM2.5處理HaCaT細胞的IC50的分析 在0～400 μg/mL范圍內(nèi)，PM2.5處理細胞24 h后對細胞活力的抑制呈劑量依賴性地上升趨勢。見圖1。不同濃度的PM2.5對細胞活力的抑制趨勢變化符合對數(shù)方程y=6.905 5ln（）+10.351，R2=0.975，計算出PM2.5的IC50約為300 μg/mL。

圖1 不同濃度的PM2.5處理HaCaT細胞對細胞活力的影響Fig.1 The effect of PM2.5 treatment with different concentrations on the inhibition of cell viability in HaCaT

2.3 PM2.5處理HaCaT細胞后細胞活力隨時間的變化趨勢 在不同時間點（0、3、9、12、15、18、24 h），PM2.5對細胞活力的抑制總體呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，其中，在處理后3 h，對細胞活力的抑制率可達30%，隨后對細胞活力的抑制呈緩慢上升趨勢。見圖2。

2.4 NC組、PM2.5組、UVB組以及聯(lián)合處理組HaCaT細胞的細胞形態(tài)及活力變化 各組在接受相應處理后24 h，NC組的HaCaT細胞呈梭形，細胞緊湊排列，邊界清晰，PM2.5組和UVB組細胞均呈現(xiàn)形態(tài)皺縮、細胞有變圓變亮的情況，聯(lián)合處理組表現(xiàn)更為明顯，出現(xiàn)細胞間隙變大，細胞完全失去正常形態(tài)。見圖3。MTT結(jié)果顯示：與NC組比，PM2.5、UVB及聯(lián)合處理24 h后細胞活力被抑制，差異顯著（P＜0.001），兩兩比較結(jié)果分析，聯(lián)合處理組細胞活力最低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），顯示PM2.5與UVB照射聯(lián)合處理對抑制細胞活力有協(xié)同作用。見圖4。

圖2 PM2.5對HaCaT細胞活力的抑制在不同時間點的變化Fig.2 The inhibitory changes of cell viability at different time points after the treatment with PM2.5 in HaCaT

圖4 NC組、PM2.5組、UVB組以及聯(lián)合處理組作用HaCaT后細胞活力變化Fig.4 The changes of cell viability after the treatment of NC，PM2.5，UVB and the combined group in HaCaT

2.5 NC組、PM2.5組、UVB組以及聯(lián)合處理組HaCaT細胞的凋亡變化 流式細胞術觀察不同因素處理情況下細胞凋亡率的變化：結(jié)果顯示各組之間有差異（P＜0.05），其順序依次為UVB組＞PM2.5+UVB組＞PM2.5組＞NC組。兩兩比較的結(jié)果顯示，與NC組相比，單獨UVB或PM2.5處理以及聯(lián)合處理，均能增加細胞的細胞凋亡率（P＜0.01）。但聯(lián)合處理組的細胞凋亡率又介于單純的PM2.5處理組和單純UVB照射組之間（P＜0.05）。見圖5、表2。

圖5 流式檢測NC組、PM2.5組、UVB組以及聯(lián)合處理組細胞凋亡變化Fig.5 Flow cytometry was used to detect the changes of apoptosis of HaCaT in NC，PM2.5，UVB and the combined group

表2 流式檢測NC組、PM2.5組、UVB組以及聯(lián)合處理組細胞凋亡百分比Tab.2 Flow cytometry was used to detect the percentage of apoptosisof HaCaT in NC，PM2.5，UVB and the combined group（n=3）±s

表2 流式檢測NC組、PM2.5組、UVB組以及聯(lián)合處理組細胞凋亡百分比Tab.2 Flow cytometry was used to detect the percentage of apoptosisof HaCaT in NC，PM2.5，UVB and the combined group（n=3）±s

注：與NC組比較，*P ＜0.01；與PM2.5比較，#P ＜0.05；與UVB比較，※P＜0.01

組別NC PM2.5 UVB PM2.5+UVB凋亡率（%）6.65±2.38 15.85±0.84*38.40±4.96*24.17±4.07*#※

2.6 NC組、PM2.5組、UVB組以及聯(lián)合處理組HaCaT細胞凋亡蛋白及自噬蛋白變化 與NC組相比，凋亡標志蛋白PARP剪切體在PM2.5組、UVB組以及聯(lián)合處理組均增加，UVB組高于PM2.5組，聯(lián)合處理后較UVB組降低。與NC組相比，LC3-Ⅱ表達在PM2.5組、UVB組以及聯(lián)合處理組均增加，聯(lián)合處理組最多，PM2.5組其次，UVB組最少。見圖6。

圖6 NC組、PM2.5組、UVB組、以及聯(lián)合處理組HaCaT細胞蛋白表達變化Fig.6 The changes of protein of HaCaT in NC，PM2.5，UVB and the combined group

3 討論

隨著我國工業(yè)化進程加快，環(huán)境污染日益加劇，空氣污染成為我國各個地區(qū)擔心的首要問題。在眾多空氣污染物中，PM2.5對人體健康的危害最嚴重。大量國內(nèi)外流行病學研究已經(jīng)報道了PM2.5對人體健康的危害，但這些研究多集中在PM2.5對呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)造成的危害［11］。近年來人們開始意識到PM2.5對皮膚系統(tǒng)的影響，但具體作用還不明確，關于PM2.5對HaCaT細胞的研究更少。臭氧空洞的形成，對太陽輻射的吸收減少，照射到地面的太陽光紫外線增加，使得人們接受到更多紫外輻射。而在現(xiàn)實生活中，人體皮膚同時會受到PM2.5、UVB兩種因素的聯(lián)合損傷。有研究表明UVB誘導氧化應激、細胞凋亡等對細胞造成損傷；PM2.5作用于HaCaT細胞后，產(chǎn)生炎癥因子誘導細胞凋亡與自噬［6，12］。但尚未有研究涉及二者的聯(lián)合作用后對細胞凋亡、自噬的影響，因此本研究嘗試性分析了PM2.5、UVB以及聯(lián)合處理對HaCaT細胞在細胞活力、凋亡、自噬方面的影響。

通過MTT實驗檢測不同濃度的PM2.5（0～400 μg/mL）處理細胞24 h細胞活力的變化，發(fā)現(xiàn)PM2.5對HaCaT細胞抑制率隨著濃度的升高而增加（圖1），這說明PM2.5對HaCaT細胞具有明顯的毒性作用，且計算出IC50為300 μg/mL，觀察到該濃度下PM2.5對細胞活力的抑制隨著時間（0～24 h）的推延，抑制效果呈上升趨勢（圖2），表明處理時間越長，PM2.5對細胞的毒性作用越強。這和熊書晗等［13］研究的PM2.5對HaCaT細胞活力的抑制作用是一致的。與NC組比，PM2.5組、UVB組、聯(lián)合處理組細胞活力均被顯著抑制（P＜0.001）；聯(lián)合處理組細胞活力小于PM2.5組、UVB組（P＜0.001），這說明PM2.5、UVB二者對細胞活力的抑制具有協(xié)同作用，兩者相加，會導致細胞更嚴重的損傷。

筆者以往的實驗中，就已經(jīng)明確UVB能影響細胞的功能，如DNA損傷、細胞凋亡等，本次研究發(fā)現(xiàn)不同處理組之間，HaCaT細胞的凋亡率依次為UVB組＞聯(lián)合處理組＞PM2.5組＞NC組，結(jié)合本研究對PM2.5金屬成分的分析，發(fā)現(xiàn)PM2.5中含有一定量的Ca，且達到了30.55 mg/L。有研究發(fā)現(xiàn)皮膚中的鈣離子與角質(zhì)形成細胞的增殖、分化密切相關［14］，高劑量UVB照射角質(zhì)細胞在低鈣培養(yǎng)基中培養(yǎng)時細胞發(fā)生凋亡，而在正常含鈣培養(yǎng)基中角質(zhì)細胞對UVB引起的凋亡有抗性，但細胞在高劑量UVB處理后失去增殖能力［15］。在本研究中，鈣離子也可能通過上述機制，影響了細胞活力，抑制了細胞凋亡的發(fā)生。

為了進一步分析聯(lián)合作用是通過何種途徑發(fā)揮對HaCaT細胞活力的影響的，筆者檢測了凋亡標志蛋白PARP和自噬標志蛋白LC3的表達。Western blot結(jié)果顯示：除NC組外，PARP蛋白在UVB組最高，聯(lián)合處理組其次，最后是PM2.5組，這與前面流式細胞術檢測出的細胞凋亡趨勢一致，進一步說明聯(lián)合處理組中細胞凋亡被抑制了，即凋亡不是細胞活力比單純致傷因素進一步降低的原因；而自噬標志蛋白LC3-Ⅱ的變化趨勢為聯(lián)合處理組＞PM2.5組＞UVB組＞NC組，聯(lián)合處理組中LC3-Ⅱ增加，這說明聯(lián)合作用后PM2.5可能誘導較強的自噬增加了UVB對HaCaT細胞的損傷。但是，聯(lián)合處理終究是通過哪些信號通路發(fā)揮作用的，其上下游信號通路有哪些，目前還不明確，也是筆者今后進一步研究的方向。

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