郭 華,刁全平,孫婷婷,侯冬巖

(鞍山師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 鞍山 114007)

甾體類(lèi)化合物是普遍存在于動(dòng)植物中的天然產(chǎn)物，種類(lèi)眾多，數(shù)量龐大，幾乎所有生物體自身都能合成.其生物活性廣泛，具有抗炎、抗腫瘤、抗休克、增強(qiáng)免疫能力和應(yīng)激反應(yīng)等藥理作用[1,2]，是一類(lèi)重要的天然有機(jī)化合物，被稱為“生命的鑰匙”[3]，因此甾體類(lèi)化合物的研究具有十分重要的意義.蘑菇中含有豐富的甾體類(lèi)化合物[4],通過(guò)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)蘑菇活性成分的測(cè)定多集中在多糖、氨基酸、維生素上,而總甾體含量的測(cè)定鮮有報(bào)道.因此,本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Liebermann-Burchard(LB)反應(yīng)，采用紫外分光光度法，建立了蘑菇中總甾體含量的測(cè)定方法.

1 儀器、試藥與試驗(yàn)材料

Cary 50 紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Varian公司)；FA1204B電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；LFP-800T 高速多功能粉碎機(jī)(浙江省永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司)；KQ-200VDB型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DK-98-II 水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司).

麥角甾醇對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)111845-201604)；氫氧化鈉、95%乙醇、乙酸酐、冰醋酸、石油醚、濃硫酸(均為分析純,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；水為實(shí)驗(yàn)室自制蒸餾水.

本研究所用香菇、滑菇、杏鮑菇、真姬菇、楊樹(shù)口蘑、松乳菇、棕灰口蘑、榛蘑，2016年購(gòu)于或采于遼寧.樣品陰干,實(shí)驗(yàn)前粉碎過(guò)0.25 mm篩備用.

2 方法與結(jié)果

2.1 顯色劑的配制

LB反應(yīng)中所用顯色試劑為乙酸酐、濃硫酸和冰醋酸，體積比20∶1∶10.首先量取乙酸酐于容量瓶中，緩慢加入濃硫酸，搖勻冷卻后加入冰醋酸，放置至室溫即可.但要注意在低溫的條件下配制顯色劑，現(xiàn)用現(xiàn)配.

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 mg麥角甾醇對(duì)照品于圓底燒瓶中，分別吸取10 mL顯色劑溶解，搖勻備用.

2.3 供試品溶液的配制

稱取1 g蘑菇樣品于圓底燒瓶中，在100 mL醇?jí)A溶液(95%乙醇-20%氫氧化鈉體積比40∶60)中熱回流提取40 min，提取液回收乙醇后，冷卻至室溫，用等體積的石油醚(30～60 ℃)萃取3次，合并石油醚的萃取液，蒸干，加10 mL 顯色劑溶解，搖勻備用.

2.4 測(cè)定波長(zhǎng)的確定和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1 對(duì)照品和樣品的吸收曲線

分別將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液在40 ℃水浴中加熱20 min，冷卻至室溫后，于20～25 min內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，顯色劑為參比，掃描結(jié)果見(jiàn)圖1.由圖 1可知，在670 nm處麥角甾醇對(duì)照品和蘑菇樣品均出現(xiàn)最大吸收峰，故以670 nm為最佳測(cè)定波長(zhǎng).以麥角甾醇對(duì)照品溶液濃度(C,mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=4.116 7C-0.017 9，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1，表明麥角甾醇在0.04～0.24 mg/mL范圍內(nèi)含量與吸光度有良好線性關(guān)系,測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)表1.

表1 麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

圖2 吸光度在不同加熱條件下隨時(shí)間變化

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液在40 ℃的水浴中分別加熱0，10，20 min，取出，冷卻至室溫，在670 nm處每隔5 min測(cè)定吸光度，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2，結(jié)果表明加熱20 min后，在20～25 min內(nèi)吸光度值比較穩(wěn)定.

2.6 精密度試驗(yàn)

取配制好的對(duì)照品溶液于40 ℃水浴中加熱20 min，冷卻至室溫，在20～25 min內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，吸光度的RSD值為0.83%.

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取相同樣品，按2.3方法平行配制 6份，于40 ℃水浴中加熱20 min，冷卻至室溫，在20～25 min期間內(nèi)測(cè)定，計(jì)算RSD值為1.23%.

表2 不同蘑菇中總甾體的含量

2.8 回收率試驗(yàn)

取6份配制好的同一供試品溶液，分別加入一定量的麥角甾醇對(duì)照品，按上述測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果回收率平均值為101.78%，RSD值(n=6)為1.79%.

2.9 樣品含量測(cè)定

按2.3樣品處理方法，分別制備8種蘑菇的供試液(平行3份),40 ℃水浴中加熱20 min，冷卻至室溫，在20～25 min內(nèi)，于670 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中總甾體的含量，結(jié)果見(jiàn)表2.

3 討論

(1)甾體類(lèi)化合物是一類(lèi)結(jié)構(gòu)特殊的天然產(chǎn)物，母體結(jié)構(gòu)中含有環(huán)戊烷駢多氫菲碳骨架(圖3)，大多缺少發(fā)色團(tuán)和助色基，揮發(fā)性較差，不具備良好的高效液相色譜和氣相色譜條件，其總含量測(cè)定有一定難度.本實(shí)驗(yàn)是根據(jù)甾體類(lèi)化合物與LB試劑產(chǎn)生的特征性顯色反應(yīng)，采用分光光度法測(cè)定總甾體含量.

圖3 甾體化合物的骨架結(jié)構(gòu)

LB反應(yīng)是Liebermann在1885年發(fā)現(xiàn)的，隨后Burchard對(duì)該反應(yīng)進(jìn)行了改進(jìn)，并把該反應(yīng)推廣到植物組織中甾醇的檢測(cè)，即現(xiàn)在Liebermann-Burchard 顯色反應(yīng)[5].LB顯色反應(yīng)的主要原理是甾體類(lèi)化合物在強(qiáng)酸的存在下，發(fā)生重排，形成發(fā)色基團(tuán)而發(fā)生的反應(yīng)[6].由于重排反應(yīng)的發(fā)生具有一定連續(xù)性，甾體類(lèi)物質(zhì)與LB試劑反應(yīng)不穩(wěn)定，顯色物質(zhì)的顏色是逐漸變化的[7]，本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)對(duì)照品及供試品在反應(yīng)中由淡綠逐漸變?yōu)樽攸S色，因此，需探究顯色反應(yīng)的穩(wěn)定區(qū)間.1952年，Kennyn對(duì)LB試劑與甾體類(lèi)化合物反應(yīng)進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同反應(yīng)溫度及時(shí)間下，產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)沒(méi)有變化，但是吸光強(qiáng)度隨著反應(yīng)時(shí)間的變化而改變[8],本實(shí)驗(yàn)也得到了驗(yàn)證：顯色反應(yīng)0,10,20 min后最大吸收波長(zhǎng)都為640 nm，而吸光度不穩(wěn)定(見(jiàn)圖2)，從穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出：40 ℃水浴中加熱20 min，冷卻至室溫，在20～25 min內(nèi)吸光度不變，為最佳檢測(cè)時(shí)間.

(2)麥角甾醇是真菌類(lèi)的特征甾體化合物[9],本文所測(cè)蘑菇樣品前1～4種編號(hào)為人工種植，后5～8種編號(hào)為野生，經(jīng)過(guò)TLC定性檢測(cè)這8種蘑菇中都含有麥角甾醇，因此本實(shí)驗(yàn)采用麥角甾醇為對(duì)照品.

(3)本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)蘑菇中總甾體的含量測(cè)定方法進(jìn)行研究.結(jié)果表明，麥角甾醇對(duì)照品和8種樣品，與LB試劑顯色反應(yīng)吸收曲線相同，都在670 nm處產(chǎn)生最大吸收，40 ℃水浴中加熱20 min，冷卻后，在20～25 min內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，具有較好的穩(wěn)定性、精密度和準(zhǔn)確性，適合用于人工種植和野生蘑菇中總甾醇的定量測(cè)定，同時(shí)為蘑菇質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考.

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[3] 邱明華,聶瑞麟.生命的鑰匙：甾族化合物[J].科學(xué),1999，51(3):18-21.

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