（長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)人文信息學(xué)院制藥工程系，吉林長(zhǎng)春130122）

杜仲（Eucommia ulmoides Olive）為杜仲科杜仲屬植物，名貴滋補(bǔ)藥材，因其富含黃酮、綠原酸、京尼平苷、丁香素二糖苷、中酯素二糖苷等生物活性物質(zhì)，從而具有補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨、調(diào)理沖任、固經(jīng)安胎之功效[1-2]。特別是主要成分綠原酸由于具有抗菌、降壓降脂、保肝利膽、增強(qiáng)機(jī)體免疫和美容養(yǎng)顏等保健作用[3]，使得近年以杜仲綠原酸提取物為原料的各類食品在市場(chǎng)不斷增多，然而提取物中鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，嚴(yán)重影響綠原酸的純度，進(jìn)而影響其食用效果，雖然前人已在其提取與分離作出大量工作，但目標(biāo)產(chǎn)物純度仍較為偏低[4-5]。

大孔樹(shù)脂吸附-洗脫作為經(jīng)典的分離純化技術(shù)，具有選擇性高、干擾因素少、可重復(fù)循環(huán)利用等特點(diǎn)，已廣泛用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等諸多領(lǐng)域[6-8]。本研究在綠原酸提取工藝基礎(chǔ)上，借鑒響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法定量分析，探討杜仲綠原酸最佳純化工藝，為其后續(xù)開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲干燥葉：亳州道興堂藥材銷售有限公司；綠原酸（定量分析用）：中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙醇、石油醚（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

722型分光光度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；AE224型電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；878-A/B型高速多功能粉碎機(jī)：常州國(guó)華電器有限公司；H-107、DM-130型大孔樹(shù)脂：陜西藍(lán)深特種樹(shù)脂有限公司；ADS-5、ADS-17、ADS-21 型大孔樹(shù)脂：滄州寶恩吸附材料科技有限公司；NKA-9型大孔樹(shù)脂：南開(kāi)大學(xué)化工廠；RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞德儀器設(shè)備有限公司；SJIA-5FE冷凍干燥機(jī)：寧波雙嘉儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

取干燥杜仲葉粉碎完全，過(guò)60目篩，稱取40 g，采用70%乙醇溶液回流提取2次，每次1 h，回收乙醇后，置于分液漏斗中，加入石油醚萃取至上層溶液近無(wú)色，取下層水液于40℃減壓濃縮后，冷凍干燥備用[9]。

1.3.2 測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[10]

分析天平精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品0.2 g，用70%乙醇分別配制濃度為 0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以70%乙醇溶液作空白溶劑，于328 nm最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定各自吸光度，繪制綠原酸濃度（X）-吸光度（Y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為：Y=1.025 X-0.104（r=0.9932），表明綠原酸濃度在0.1 mg/mL～1.0 mg/mL時(shí)，吸光度與其線性關(guān)系良好。

1.3.3 樹(shù)脂預(yù)處理

將大孔樹(shù)脂24 h浸泡于90%乙醇中，充分溶脹后濕法裝柱，后用90%乙醇反復(fù)沖洗，直至流出液與水混合（體積比為=1∶5）無(wú)白色渾濁出現(xiàn)，再用水洗至無(wú)乙醇?xì)馕?，加?%鹽酸浸泡3 h，用水洗至中性；再用3%氫氧化鈉溶液浸泡3 h，用水洗至中性，備用[11]。

1.3.4 樹(shù)脂型號(hào)選擇

稱取2.0 g 6種極性不同的大孔樹(shù)脂（H-107、ADS-5、DM-130、ADS-17、NKA-9、ADS-21）置于錐形瓶?jī)?nèi)，分別加入等濃度的杜仲綠原酸提取液50 mL后，放入振動(dòng)器中，靜態(tài)吸附24 h，使大孔樹(shù)脂吸附綠原酸飽和，隨后過(guò)濾，蒸干濾液。通過(guò)下式計(jì)算得到不同類型大孔樹(shù)脂靜態(tài)飽和吸附量與吸附率。

式中：m0為提取液綠原酸質(zhì)量，mg；me為飽和吸附后濾液中綠原酸質(zhì)量，mg；m為干燥的大孔樹(shù)脂質(zhì)量，g；Γe為靜態(tài)飽和吸附量，mg/g；Qe為靜態(tài)飽和吸附率，%。

將過(guò)濾后的樹(shù)脂置于錐形瓶?jī)?nèi)，加入70%乙醇30 mL，放于振蕩器中，靜態(tài)洗脫24 h，過(guò)濾，測(cè)定濾液綠原酸含量，通過(guò)下式計(jì)算不同類型樹(shù)脂的洗脫率與回收率。

式中：m0為提取液綠原酸質(zhì)量，mg；me為飽和吸附后濾液中綠原酸質(zhì)量，mg；md為洗脫液綠原酸質(zhì)量，mg；Dd為靜態(tài)洗脫率，%；R 為回收率，%。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

1.3.5.1 上樣液質(zhì)量濃度影響

分別配制20 mL杜仲綠原酸提取液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mg/mL，控制上樣流速 3.0 BV/h，加入至預(yù)處理后的DM-130型大孔樹(shù)脂內(nèi)，收集柱后流出液，分別測(cè)定其綠原酸含量。

1.3.5.2 洗脫液濃度影響

杜仲綠原酸極性較大，因此選擇一定濃度的乙醇溶液作為洗脫劑，然而乙醇溶液濃度過(guò)高，易使得柱內(nèi)殘余極性較小的雜質(zhì)被洗脫，濃度過(guò)低又導(dǎo)致綠原酸不易洗脫完全，因此選擇合適的洗脫液濃度尤為重要。按前述最佳條件上樣后，分別采用5.0 BV的40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，以2.0 BV/h流速洗脫，收集洗脫液，分別測(cè)定其綠原酸含量。

1.3.5.3 洗脫液體積影響

將50 mL濃度為3 mg/mL的杜仲綠原酸提取液，以3.0 BV/h上樣至預(yù)處理后的大孔樹(shù)脂柱內(nèi)，吸附結(jié)束后，采用體積分別為 3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 BV 的50%乙醇溶液，以2.0 BV/h流速洗脫，收集洗脫液，分別測(cè)定其綠原酸含量。

1.3.5.4 洗脫流速影響

洗脫流速越慢，洗脫液對(duì)樹(shù)脂吸附的綠原酸洗脫效果越好，分別對(duì) 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h 的洗脫液流速進(jìn)行洗脫率考察。按照前述最佳條件上樣后，采用5.0 BV 50%乙醇溶液照上述5種不同洗脫流速對(duì)吸附的綠原酸洗脫，收集洗脫液，分別測(cè)定其綠原酸含量。

1.3.5.5 上樣流速影響

配制3.0 mg/mL杜仲提取液50 mL，分別控制上樣流速 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 BV/h，加入至預(yù)處理后的DM-130型大孔樹(shù)脂內(nèi)，收集柱后流出液，分別測(cè)定其綠原酸含量。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以上樣液質(zhì)量濃度（A）、洗脫液濃度（B）、洗脫液體積（C）、洗脫流速（D）、上樣流速（E）為響應(yīng)因素，回收率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行五因素三水平的響應(yīng)面（response surface methodology，RSM）分析試驗(yàn)，確定杜仲綠原酸的最佳純化工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物中綠原酸含量測(cè)定

以70%乙醇溶液作為空白對(duì)照，精密稱取杜仲綠原酸提取物0.5 g，用70%乙醇溶液定容于100 mL容量瓶中于328 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3次，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣品含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1所示。

表1 杜仲提取物中綠原酸含量Table 1 The content of chlorogenic acid of Eucommla ulmoides extract

2.2 樹(shù)脂型號(hào)選擇

表2為不同類型樹(shù)脂的靜態(tài)吸附與洗脫性能比較。從表2可知，DM-130型大孔樹(shù)脂的回收率均高于其它5類樹(shù)脂，達(dá)到80.6%，這歸因于綠原酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)上含有羧基和羥基，具有一定的極性，DM-130型大孔樹(shù)脂特殊的空間結(jié)構(gòu)與弱極性，恰好與綠原酸產(chǎn)生較好的物理吸附，因此確定其作為純化杜仲綠原酸的吸附樹(shù)脂。

表2 不同類型樹(shù)脂的靜態(tài)吸附與洗脫性能比較Table 2 Comparison of static adsorption and desorption performance of different macroporous resins

2.3 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)

根據(jù)“1.3.4”中靜態(tài)吸附試驗(yàn)條件，在不同時(shí)間段測(cè)定DM-130型大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附綠原酸質(zhì)量，繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力曲線，見(jiàn)圖1所示。

圖1 DM-130型大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力曲線Fig.1 Static adsorption curve of DM-130 macroporousresin

樹(shù)脂對(duì)綠原酸吸附量隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而增大，在8 h左右趨于飽和，DM-130型大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附杜仲提取物中綠原酸耗時(shí)理想，能夠滿足相關(guān)工業(yè)生產(chǎn)要求。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 上樣液質(zhì)量濃度影響

不同上樣液質(zhì)量濃度對(duì)綠原酸吸附率的影響，見(jiàn)圖2所示。

從圖2可見(jiàn)，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)，樹(shù)脂對(duì)綠原酸的吸附率達(dá)到89.2%，繼續(xù)增大上樣液濃度，吸附率開(kāi)始下降，因此選擇4.5、5.0、5.5 mg/mL作為上樣液質(zhì)量濃度的響應(yīng)因素水平。

2.4.2 洗脫液濃度影響

不同洗脫液濃度對(duì)綠原酸洗脫率的影響，見(jiàn)圖3所示。

從圖3可知，當(dāng)洗脫液為60%乙醇溶液，綠原酸洗脫率達(dá)到平衡，因此選擇55%、60%、65%作為洗脫液濃度的響應(yīng)因素水平。

圖2 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)綠原酸回收率影響Fig.2 Effect of loading solution concentration on the recovery of chlorogenic acid

圖3 洗脫液濃度對(duì)綠原酸回收率影響Fig.3 Effect of concentration of eluent on the recovery of chlorogenic acid

2.4.3 洗脫液體積影響

不同洗脫液體積對(duì)綠原酸的洗脫率影響，見(jiàn)圖4所示。

圖4 洗脫液體積對(duì)綠原酸回收率影響Fig.4 Effect of volume of eluent on the recovery of chlorogenic acid

從圖4可見(jiàn)，當(dāng)洗脫液體積為7.0 BV時(shí)，洗脫率達(dá)到平衡，因此選擇6.5、7.0、7.5 BV作為洗脫液用量的響應(yīng)因素水平。

2.4.4 洗脫流速影響

不同洗脫流速對(duì)綠原酸洗脫率的影響，見(jiàn)圖5所示。

圖5 洗脫流速對(duì)綠原酸回收率影響Fig.5 Effect of flow rate of eluent on the recovery of chlorogenic acid

從圖5可見(jiàn)，隨著洗脫流速的增大，洗脫率不斷減小，考慮生產(chǎn)時(shí)間，選擇1.5、2.0、2.5 BV/h作為洗脫流速的響應(yīng)因素水平。

2.4.5 上樣流速影響

不同上樣流速對(duì)綠原酸吸附率的影響，見(jiàn)圖6所示。

圖6 上樣流速對(duì)綠原酸回收率影響Fig.6 Effect of flow rate of sample solution on the recovery of chlorogenic acid

從圖6可見(jiàn)，樹(shù)脂對(duì)綠原酸的吸附率隨著流速的增大而減小，但流速過(guò)低，會(huì)延長(zhǎng)吸附時(shí)間，因此綜合考慮，選擇2.5、3.0、3.5 BV/h作為上樣流速的響應(yīng)因素水平。

2.5 響應(yīng)面法分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，各響應(yīng)因素水平見(jiàn)表3所示。表4為試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與響應(yīng)結(jié)果，對(duì)表4進(jìn)行多元回歸擬合，得到以回收率為目標(biāo)函數(shù)，關(guān)于各參數(shù)編碼值的二次回歸方程：

Y=90.18+0.28A+0.062B+0.10C+0.36D+0.33E+0.50AB-0.15AC-0.05AD+0.23AE-0.10BC-0.075BD-0.27BE-0.10CD+0.50CE+0.025DE-0.40A2-0.60B2-0.84C2-0.25D2-0.48E2，對(duì)該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并進(jìn)行可信度分析，結(jié)果見(jiàn)表5所示。

表3 響應(yīng)面分析因素及水平Table 3 Factors and levels of response surface design

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 4 Design and results of the Box-Behnken

續(xù)表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Continue table 4 Design and results of the Box-Behnken

表5 回歸方程方差分析Table 5 Variance analysis for the fitted regression mode

從表5可知，該回歸模型P＜0.01，表明該回歸模型對(duì)綠原酸回收率具有較好的預(yù)測(cè)性，同時(shí)R2=0.9074與Adj.R2=0.8332都接近于1，表示該模型可靠程度較高，試驗(yàn)誤差小。變異系數(shù)小于1%，說(shuō)明模型外因素對(duì)響應(yīng)值的影響較小，從而該回歸方程可替代實(shí)際值對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。一次項(xiàng)A、D、E對(duì)綠原酸回收率的影響顯著，二次項(xiàng) B2、C2、D2、E2對(duì)試驗(yàn)影響結(jié)果影響顯著，交互項(xiàng)AB、BE、CE對(duì)結(jié)果影響顯著，其它交互項(xiàng)影響均不顯著。從F值可知，影響綠原酸回收率的強(qiáng)弱順序?yàn)椋合疵摿魉伲旧蠘恿魉伲旧蠘右嘿|(zhì)量濃度＞洗脫液體積＞洗脫液濃度。

2.6 響應(yīng)面模型分析

圖7反映了各兩因素交互作用的響應(yīng)面。

圖7 各兩因素交互作用的響應(yīng)面Fig.7 Response surface of different two factors interaction

通過(guò)解二次多項(xiàng)回歸擬合方程得到最優(yōu)條件為：將質(zhì)量濃度為5.5 mg/mL的杜仲綠原酸提取液，以2.45 BV/h流速上樣至DM-130型大孔樹(shù)脂內(nèi)，隨后采用7.5BV的55%乙醇溶液，以1.87 BV/h流速洗脫，預(yù)測(cè)最大回收率為90.7%。

2.7 驗(yàn)證性試驗(yàn)

為了驗(yàn)證響應(yīng)面法所得最佳純化工藝和可實(shí)施性，通過(guò)試驗(yàn)確定最佳純化工藝參數(shù)。將質(zhì)量濃度為5.5 mg/mL的杜仲綠原酸提取液，以2.5 BV/h流速上樣至DM-130型大孔樹(shù)脂內(nèi)，隨后采用7.5 BV的55%乙醇溶液，以2.0 BV/h流速洗脫，收集洗脫液，定量分析綠原酸含量，結(jié)果見(jiàn)表6所示。

表6 純化前后提取物中綠原酸含量Table 6 The content of chlorogenic acid of extracts before and after purification

從表6可知，綠原酸回收率平均值與預(yù)測(cè)值較為接近，回收率為90.5%，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的杜仲綠原酸提取物純化參數(shù)準(zhǔn)確可靠，對(duì)相關(guān)工業(yè)生產(chǎn)具有一定指導(dǎo)作用。提取物中綠原酸含量由純化前134.5 mg/g，提高至純化后341.2 mg/g，為純化前的2.5倍。

3 結(jié)論

本研究選用6種大孔樹(shù)脂純化杜仲提取物中綠原酸，響應(yīng)面法結(jié)果表明：配制5.5 mg/mL的杜仲提取物，以2.5 BV/h流速，上樣至DM-130型大孔樹(shù)脂中吸附，隨后采用7.5 BV的55%乙醇溶液，以2.0 BV/h流速洗脫，綠原酸回收率為90.5%，所得洗脫液綠原酸含量為純化前的2.5倍。該工藝操作簡(jiǎn)便、純化效率較高，從而適合推廣于相關(guān)工業(yè)應(yīng)用。

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