鄒青飛，吳躍中，楊士花，李永強，*，張一鳴，李雪良，郭馨昕

（1.云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，云南昆明650201；2.云南省耿馬傣族佤族自治縣氣象局，云南臨滄677500；3.云南農(nóng)業(yè)大學外語學院，云南昆明650201）

色素分為天然色素和合成色素兩種。天然色素主要從植物中提取，也有一部分從動物和微生物中提取；合成色素即人工合成的色素，主要以苯胺為原料制成[1-2]。研究表明，大部分合成色素均有不同程度的毒性，危害人體健康；與之相比，天然色素安全性較高、具有營養(yǎng)價值和藥理作用，同時天然色素著色時色調(diào)更接近天然物質(zhì)的顏色，所以天然色素具有良好的開發(fā)前景[3-7]。

仙人掌果（Opuntia ficus-indica）為仙人掌屬，原產(chǎn)南北美洲熱帶、亞熱帶大陸及附近一些島嶼。目前在云南，廣西，海南等地有種植。仙人掌果含有較多的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、多糖類、黃酮醇類、果膠和豐富的微量元素，具有行氣活血、祛濕退熱、生肌等功效[8]。本試驗通過對仙人掌果色素的初步定性，以吸光度為指標，在單因素試驗基礎上，通過二次通用旋轉(zhuǎn)試驗設計優(yōu)化，確定該色素的最優(yōu)提取工藝，并對該色素進行體外抗氧化活性測定。旨在為今后仙人掌果色素資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，促進我國天然色素的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

仙人掌果：云南省大理市農(nóng)貿(mào)市場；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、1，1-二苯基-2-苦基肼基（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、2，2-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2-azinobis（3-ethylbenzothia-zoline）-6-sulfonate，ABTS）、2，4，6-三吡啶基三嗪（2，4，6-tris（2-pyridy1）-S-tria-zine，TPTZ）、三氯化鐵、過氧化氫、硫酸亞鐵、抗壞血酸：上海純生化科技股份有限公司；阿魏酸、兒茶素：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1800CP紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；TDL-5-A離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 色素的初步定性

準確稱取9份1 g樣品，置于研缽中分別加入10 mL配好的鹽酸甲醇、鹽酸乙醇、1%鹽酸、60%乙醇、80%乙醇、60%甲醇、丙酮、石油醚、蒸餾水，研磨、過濾，分別用不同的提取溶劑定容于50 mL容量瓶中，在190 nm～1100 nm波長下進行全波長掃描，確定最佳提取溶劑和最大吸收波長，并對色素進行初步定性。

1.3.2 單因素試驗

以吸光度為指標，分析不同條件下提取次數(shù)、提取時間、提取溫度和液料比值對仙人掌果色素提取效率的影響。

1.3.2.1 提取次數(shù)對色素提取率的影響

準確稱取1 g樣品置于研缽中將其磨碎并轉(zhuǎn)移至100mL錐形瓶，加入10mL80%乙醇作為提取溶劑，在室溫下（25℃）分別提取1、2、3、4次，提取時間為1.5h，過濾后用提取溶劑將濾液定容于100 mL容量瓶中，進行3次平行試驗，分別于272nm和324 nm處測定吸光度。

1.3.2.2 提取時間對色素提取率的影響

準確稱取1 g樣品置于研缽中將其磨碎并轉(zhuǎn)移至100 mL錐形瓶，加入10 mL 80%乙醇作為提取溶劑，在室溫下（25 ℃）分別提取 0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，提取次數(shù)為2次，過濾后用提取溶劑將濾液定容于100 mL容量瓶中，進行3次平行試驗，分別于272nm和324nm處測定吸光度。

1.3.2.3 提取溫度對色素提取率的影響

準確稱取1 g樣品置于研缽中將其磨碎并轉(zhuǎn)移至100 mL錐形瓶，加入10 mL 80%乙醇作為提取溶劑，分別在 20、30、40、50、60、70 ℃下進行提取，提取次數(shù)為2次，提取時間為1.5 h，過濾后用提取溶劑將濾液定容于100 mL容量瓶中，進行3次平行試驗，分別于272 nm和324 nm處測定吸光度。

1.3.2.4 液料比值對色素提取率的影響

準確稱取1 g樣品置于研缽中將其磨碎并轉(zhuǎn)移至100 mL 錐形瓶，之后分別加入 5、10、15、20、25、30 mL的80%乙醇作為提取溶劑，于室溫下（25℃）提取1.5 h，提取次數(shù)為2次，過濾后用提取溶劑將濾液定容于100 mL容量瓶中，進行3次平行試驗，分別于272 nm和324 nm處測定吸光度。

1.3.3 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗設計[9-15]

利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進行二次通用旋轉(zhuǎn)試驗設計，確定仙人掌果色素的最優(yōu)提取工藝。

1.3.4 體外抗氧化活性測定

1.3.4.1 色素溶液制備

稱取1 g新鮮仙人掌果，在最優(yōu)提取條件下進行色素提取，之后將提取的色素溶液定容于50 mL容量瓶備用。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力測定（DPPH radical scavenging activity，DRSA）

取1 mL色素提取液與4 mL DPPH甲醇溶液混合，之后進行渦旋振搖，將兩者混合物室溫下暗處放置10 min，然后于517 nm波長下比色測定，并根據(jù)標準曲線計算DPPH自由基的清除率[16-17]。利用阿魏酸繪制標準曲線，標準曲線方程為：

式中：y為DPPH自由基清除率，%；x為阿魏酸濃度，μmol/L；每克樣品中DPPH自由基清除能力相當于阿魏酸的微摩爾數(shù)（μmol FAE/g）。

DPPH自由基清除率/%=[（A0-A1）/A0]×100

式中：A0為DPPH溶液本身吸光度；A1為樣品溶液的吸光度。

1.3.4.3 鐵離子還原/抗氧化能力測定（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）

FRAP溶液配制：將乙酸緩沖溶液（300 mmol/L，pH3.6）、六水三氯化鐵（20 mmol/L）和三吡啶基三嗪（10 mmol/L）以體積比10∶1∶1充分混勻制成FRAP溶液。

取3 mL的FRAP溶液與1 mL色素提取液充分混合，于37℃下反應4 min，用乙醇做空白，在593 nm波長處測定吸光度[16-19]。用FeSO4標準儲備液繪制標準曲線。標準方程為：

式中：y為吸光度；x為硫酸亞鐵濃度，mmol/L；每克樣品中鐵離子還原能力相當于Fe2+的微摩爾數(shù)（mmol FE/g）。

1.3.4.4 總抗氧化能力測定（trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）

將2.45 mmol/L的過硫酸鉀與7 mmol/L的ABTS等體積混合，于4℃條件反應16 h配制得到ABTS工作液。取0.05 mL的色素提取液與1.9 mL的ABTS工作液室溫條件反應6 min，用乙醇作為空白，于734 nm波長下測定吸光度，并根據(jù)標準曲線計算ABTS+·清除能力[16，20-21]。利用Trolox繪制標準曲線，標準方程為：

式中：y為 ABTS+·清除率，%；x為 Trolox濃度，mmol/L；每克樣品中ABTS+·清除能力相當于Trolox的微摩爾數(shù)（μmol TE/g）。

ABTS+·清除率/%=[（A0-A1）/A0]×100

式中：A0為空白吸光度；A1為樣品的吸光度。

1.3.4.5 還原能力測定（reducing power，RP）

吸取1 mL的色素提取液，加入2.5 mL的磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 6.6），2.5 mL10%三氯乙酸溶液，混合均勻后加入2.5 mL10%TCA溶液，于4000 g離心10 min；取上清1 mL加入0.5 mL 0.1%FeCl3溶液和2.5 mL蒸餾水，用乙醇作為空白對照，于700 nm波長處測定吸光度[16，22-23]。用抗壞血酸繪制標準曲線，建立標準方程為：

式中：y為吸光度；x為抗壞血酸濃度，μmol/L；每克樣品中還原能力相當于抗壞血酸的微摩爾數(shù)（μmol AAE/g）。

1.3.4.6 過氧化氫清除能力測定（hydrogen peroxide scavenging activity，HPSA）

取0.3 mL色素提取液加入0.5 mL的H2O2（40 mmol/L），再加入0.75 mL磷酸鈉緩沖溶液（45 mmol/L，pH 7.4），在 30℃下暗反應 40 min，用乙醇作為空白對照于230 nm波長下測定吸光度[16，24-25]。用阿魏酸繪制標準曲線，標準方程為：

式中：y為H2O2清除率，%；x為阿魏酸濃度，μmol/L；每克樣品中H2O2清除能力相當于阿魏酸的微摩爾數(shù)（μmol FAE/g）。

式中：A0為H2O2自身吸光度；A1為樣品的吸光度。

2 結果與分析

2.1 仙人掌果色素初步定性

仙人掌果色素全波長掃描見圖1。

圖1 仙人掌果色素在各溶劑中的吸收波長Fig.1 The absorption wavelength of cactus fruit pigment in various solvents

由圖1可知，仙人掌果色素易溶于醇類溶劑，微溶于蒸餾水，不溶于石油醚，該色素為醇溶性色素。80%乙醇提取條件下的吸光度最大，故選取80%乙醇作為提取溶劑。同時可以看出，在272 nm和324 nm處出現(xiàn)波峰，故色素的最大吸收波長為272 nm和324 nm。初步定性仙人掌果色素為黃酮醇類色素[26-27]。

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取次數(shù)對色素提取率的影響

提取次數(shù)對色素提取率的影響結果見圖2。

圖2 272 nm和324 nm條件下提取次數(shù)對色素提取率的影響Fig.2 The effect of extraction times on extraction rate of pigment under the conditions of figure 272 nm and 324 nm

由圖2可知，在波長為272 nm和324 nm的提取條件下，吸光度隨著提取次數(shù)的增加呈現(xiàn)先增大后平緩的趨勢，且272 nm波長下吸光度始終大于324 nm波長下吸光度，當提取2次后吸光度逐漸趨于平緩。分析原因可能為：當提取次數(shù)為2次時，色素基本提取完全。故選取2次為最佳的提取次數(shù)。

2.2.2 提取時間對色素提取率的影響

提取時間對色素提取率的影響結果見圖3。

圖3 272 nm和324 nm條件下提取時間對色素提取率的影響Fig.3 The effect of extraction time on extraction rate of pigment under the conditions of figure 272 nm and 324 nm

由圖3可知，在波長為272 nm和324 nm的提取條件下，吸光度隨著提取時間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且272 nm波長下吸光度始終大于324 nm波長下吸光度，當提取時間為1.5 h時，吸光度達到最大，272 nm波長下吸光度為0.596，324 nm波長下吸光度為0.323。分析原因可能為，色素隨著提取時間的延長而被氧化。故選取1.5 h為最佳提取時間。

2.2.3 提取溫度對色素提取率的影響

提取溫度對色素提取率的影響結果見圖4。

圖4 272 nm和324 nm條件下提取溫度對色素提取率的影響Fig.4 The effect of extraction temperature on extraction rate of pigment under the conditions of figure 272 nm and 324 nm

由圖4可知，在波長為272 nm和324 nm的提取條件下，吸光度隨著提取溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，且272 nm波長下吸光度始終大于324 nm波長下吸光度，當提取溫度為60℃時，吸光度達到最大，272 nm波長下吸光度為0.580，324 nm波長下吸光度為0.178。分析原因可能為：色素在過高溫度下會氧化分解。故選取60℃為最佳提取溫度。

2.2.4 液料比值對色素提取率的影響

液料比值對色素提取率的影響結果見圖5。

圖5 272 nm和324 nm條件下液料比值對色素提取率的影響Fig.5 The effect of the ratio of liquid and material on the extraction rate of pigment under the conditions of figure 272 nm and 324 nm

由圖5可知，在波長為272 nm和324 nm提取條件下，吸光度隨著提取液料比值的升高呈現(xiàn)先上升后平緩趨勢，且272 nm波長下吸光度始終大于324 nm波長下吸光度，當提取液料比值為10時，吸光度達到最大。之后隨著液料比值的增加，吸光度趨于平緩。分析原因可能為：隨著液料比值的增加，色素被全部提取。故選取10 mL/g為最佳提取液料比值。

2.3 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗設計優(yōu)化

因素水平編碼表見表3，二次通用旋轉(zhuǎn)試驗設計方案及結果見表4。

表3 因素水平編碼表Table 3 Factor level coding table

表4 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗方案及結果Table 4 Scheme and results of two general rotation test

2.3.1 數(shù)學模型的建立與檢驗

用DPS軟件對試驗結果進行分析，得到二次回歸模型為：

Y(272nm)=0.42745-0.06927X1+0.01018X2+0.03225X3-0.03281X12+0.00062X22+0.00111X1X22+0.01306X1X3+0.00574X2X3

Y(342nm)=0.16693-0.02830X1+0.00780X2+0.01429X3-0.01611X12-0.00042X22-0.00095X32-0.00067X1X2+0.00885X1X3+0.00375X2X3。

2.3.2 根據(jù)試驗結果進行272 nm波長方差分析

回歸方程方差分析見表5。

表5 回歸方程方差分析表Table 5 Variance analysis table of regression equation

由表5可知，擬合檢驗P=0.0061＜0.01，達到極顯著水平，失擬項檢驗P=0.1363＞0.05，失擬項不顯著。說明該方程與實際情況擬合良好，能夠反映色素提取率與提取溫度、液料比值和提取時間的關系。

2.3.3 變量轉(zhuǎn)換直接尋優(yōu)

根據(jù)已建立的數(shù)學模型，在-1.68≤Xi≤1.68（i＝1，2，3）范圍內(nèi)，每個因素取 5 個水平（±1.68，±1，0），對53＝125個方案進行統(tǒng)計尋優(yōu)，在試驗范圍內(nèi)可得吸光度的最高值為0.52，此時各因素取值為：X1＝-1，X2=-0.06，X3＝0.35，對應著提取溫度為 40 ℃，提取時間為0.97 h，液料比值為11.75 mL/g。

2.3.4 頻率分析及統(tǒng)計尋優(yōu)

各變量取值的頻率分布見表6。

由表6可以看出，在95%的置信區(qū)間內(nèi)的優(yōu)化方案為：提取溫度為37.24℃～43.68℃，提取時間為0.84h～1.16 h，液料比值為 10.42 mL/g～13.22 mL/g。為了貼近實際的工業(yè)化生產(chǎn)，可將優(yōu)化方案定為：提取溫度為40℃，提取時間為1 h，液料比值為12 mL/g。對該方案進行驗證試驗，得出色素溶液在272 nm下吸光度為0.5169，與優(yōu)化的最佳值0.52較為接近，進一步驗證了該方案的可靠性。

表6 優(yōu)化提取方案中Xi取值頻率分布表Table 6 The frequency distribution table of Xi value in the optimization extraction scheme

2.3.5 根據(jù)試驗結果進行324 nm波長方差分析

回歸方程方差分析見表7。

表7 回歸方程方差分析表Table 7 Variance analysis table of regression equation

由表7可知，擬合檢驗P=0.016＜0.05，達到顯著水平，失擬檢驗P=0.1793＞0.05，失擬項不顯著。說明方程與實際情況擬合良好，能夠反映色素提取率與提取溫度、液料比值和提取時間的關系。

2.3.6 變量轉(zhuǎn)換直接尋優(yōu)

根據(jù)已建立的數(shù)學模型，在-1.68≤Xi≤1.68（i＝1，2，3）范圍內(nèi)，每個因素取 5 個水平（±1.68，±1，0），對53＝125個方案進行統(tǒng)計尋優(yōu)，在試驗范圍內(nèi)可得吸光度的最高值為 0.2，此時各因素取值為：X1＝-1，X2=-0.1，X3＝0.372，對應著提取溫度為40℃，提取時間為0.95 h，液料比值為11.86（mL/g）。

2.3.7 頻率分析及統(tǒng)計尋優(yōu)

各變量取值的頻率分布見表8。

表8 優(yōu)化提取方案中Xi取值頻率分布表Table 8 The frequency distribution table of Xi value in the optimization extraction scheme

由表8可以看出，在95%的置信區(qū)間內(nèi)的優(yōu)化方案為：提取溫度為38.42℃～45.04℃，提取時間為0.84 h～1.16 h，液料比值為 11.02 mL/g～13.86 mL/g。為了貼近實際的工業(yè)化生產(chǎn)，可將優(yōu)化方案定為：提取溫度為40℃，提取時間為1 h，液料比值為12 mL/g。對該方案進行驗證試驗，得出色素溶液在324 nm下吸光度為0.1984，與優(yōu)化的最佳值0.2較為接近，進一步驗證了該方案的可靠性。

2.4 體外抗氧化能力測定

仙人掌果色素的5種體外抗氧化能力測定結果見表9。

表9 仙人掌果色素抗氧化能力測定Table 9 Determination of antioxidant capacity of the pigment in Opuntia ficus-indica

3 結論

仙人果色素易溶于乙醇和甲醇，微溶于蒸餾水，不溶于石油醚，確定該色素為醇溶性色素，最大吸收波長為272 nm和324 nm。經(jīng)初步定性，仙人掌果色素為黃酮醇。仙人掌果色素最優(yōu)提取工藝參數(shù)：提取溫度40℃，提取時間1 h，液料比值12 mL/g，提取次數(shù)2次。仙人掌果色素的體外抗氧化試驗顯示：仙人果色素具有較強的抗氧化性。

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