丁鑫，孟祥敏，賀陽(yáng)，許志新，初百吉，文連奎

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

北冰紅山葡萄（Vitis amurensis Rupr）是以“左優(yōu)紅”為母本，“86-24-53”為父本通過(guò)雜交而成的山葡萄新品種[1]。北冰紅具有較好的抗寒、抗病特性，所釀冰酒口感滑潤(rùn)，酒香醇厚，因此成為冰葡萄酒釀造的主要品種[2-4]。

多酚是具有苯環(huán)并結(jié)合多個(gè)羥基化學(xué)結(jié)構(gòu)的一類化合物，植物葉片、花瓣和果實(shí)的不同顏色都與多酚物質(zhì)相關(guān)[5]，研究表明，多酚類化合物具有降血脂、清除自由基、防止衰老和腫瘤、抗動(dòng)脈硬化等保健功能[6-9]，對(duì)葡萄漿果和葡萄酒的質(zhì)量有較大影響[10-11]。北冰紅屬于雜交新品種，對(duì)其酚類物質(zhì)變化規(guī)律的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

目前，測(cè)定葡萄中總酚含量的方法大多采用福林-酚比色法[12-15]。由于不同植物的多酚含量與種類不盡相同，因此若用福林-酚比色法測(cè)定不同植物中的總酚含量時(shí)，需對(duì)其條件進(jìn)行改進(jìn)。本文采用福林-酚比色法對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化后，測(cè)定北冰紅果實(shí)轉(zhuǎn)色至冰凍期多酚物質(zhì)的含量，研究其發(fā)育過(guò)程中總酚含量的變化趨勢(shì)，為提高北冰紅冰葡萄酒的酒質(zhì)提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北冰紅山葡萄：于2016年采于通化市柳河縣葡萄酒研發(fā)中心葡萄基地；福林-酚試劑：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（分析純）：北京化工廠；沒(méi)食子酸（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水碳酸鈉（分析純）：西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LXJ-IIB低速大容量多管離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱恒溫水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司；FA-2004電子天平：上海精天電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采摘

自2016年8月17日開(kāi)始每5天采樣一次，直至9月30日，此后每10天采樣一次，到11月30日結(jié)束。每次剪取葡萄果實(shí)100粒左右，分裝于保鮮袋中，-18℃保藏。試驗(yàn)前室溫解凍。

1.3.2 樣品的制備及溶液配制

取解凍后北冰紅去籽，破碎，取破碎后的北冰紅果實(shí)（20.00±0.50）g放入250 mL容量瓶中，加入一定量95%甲醇，60 kHz超聲波提取30 min，95%甲醇定容至250 mL，6000 r/min 4℃冷凍離心15 min，取上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

0.1 mg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取（0.0010±0.0005）g C7H6O5·H2O，蒸餾水定容至100 mL。

1.3.3 碳酸鈉與福林酚試劑用量的確定

碳酸鈉用量的確定：取7份1 mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL的具塞試管中，分別加入1 mL的福林-酚試劑，混勻靜置 30 s 分別加入 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 12%Na2CO3溶液，蒸餾水定容至 25 mL，常溫避光反應(yīng)2 h，765 nm測(cè)量吸光度，確定最大吸光度對(duì)應(yīng)的福林-酚試劑與Na2CO3溶液的體積比。

福林-酚用量的確定：取7份1 mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于 25 mL 具塞試管中，分別加入 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL福林-酚試劑，混勻靜置30 s后分別加入 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL 的 12%Na2CO3溶液，蒸餾水定容至25 mL，常溫避光反應(yīng)2 h后，765 nm測(cè)量吸光度，確定福林-酚試劑與反應(yīng)液的體積比。

1.3.4 最佳反應(yīng)溫度的確定

取7份1 mL樣品液于25 mL具塞試管中，分別加入4 mL福林-酚試劑，混勻靜置30 s，加入8 mL 12%Na2CO3溶液，蒸餾水定容至 25 mL，分別在 12、16、20、24、28、32、36 ℃的溫度下避光反應(yīng) 2 h，765 nm 測(cè)量吸光度，確定最佳的反應(yīng)溫度。

1.3.5 最佳顯色時(shí)間的確定

取7份1mL樣品液于25 mL具塞試管中，分別加入4 mL福林-酚試劑，混勻靜置30 s，加入8 mL 12%Na2CO3溶液，蒸餾水定容至25 mL，最佳反應(yīng)溫度下分別避光反應(yīng) 1、2、3、4、5、6、7 h，765 nm 測(cè)量吸光度，確定最佳的顯色時(shí)間。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

移取 0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL具塞試管中，分別加入4 mL福林-酚試劑，混勻靜置30 s，加入8 mL 12%Na2CO3溶液，蒸餾水定容至25 mL，20℃避光反應(yīng)4 h，以0樣為空白，765 nm測(cè)量吸光度，以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 樣品總多酚含量的測(cè)定

移取1 mL樣品液于25 mL具塞試管中，加入4 mL福林-酚試劑，混勻靜置30 s，加入8 mL 12%Na2CO3溶液，蒸餾水定容至25 mL，20℃避光反應(yīng)4 h，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品液中總多酚含量。

1.3.8 分析方法的評(píng)價(jià)

精密度試驗(yàn)：取5份相同處理的樣品溶液100 μL于25 mL具塞試管中，按照總酚含量測(cè)定的最佳條件，測(cè)定吸光度，計(jì)算相對(duì)偏差，評(píng)價(jià)精密度。

重復(fù)性試驗(yàn)：取5份20 g同一日期取樣的葡萄果實(shí)，參照樣品制備方法，平行制備5份樣品溶液，按照總酚含量測(cè)定的最佳條件，測(cè)定吸光度，計(jì)算平均多酚的含量。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取5份同一處理的樣品溶液100 μL于25 mL具塞試管中，按照總酚含量測(cè)定的最佳條件，于 20 ℃條件下繼續(xù)放置 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h 后在765 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算相對(duì)偏差，評(píng)價(jià)穩(wěn)定性。

加標(biāo)回收試驗(yàn)：取5份同一處理的樣品溶液100 μL于25 mL具塞試管中，分別加入不同體積濃度為 0.1 mg/mL 的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，混勻后加入福林-酚試劑4 mL，混勻靜置30 s后加入12%Na2CO3溶液8 mL，蒸餾水定容至25 mL，于20℃避光反應(yīng)4 h測(cè)量吸光度，計(jì)算沒(méi)食子酸的回收率，計(jì)算相對(duì)偏差，評(píng)價(jià)精密度和可靠性。

2 結(jié)果分析

2.1 顯色劑用量的確定

2.1.1 12%Na2CO3用量的確定

福林-酚比色法中Na2CO3溶液是反應(yīng)體系的緩沖液，Na2CO3溶液用量的多少在很大程度上影響多酚物質(zhì)的顯色效果，用量不足則使多酚物質(zhì)顯色不完全，吸光度偏低。12%Na2CO3對(duì)顯色效果的影響如圖1所示。

圖1 12%Na2CO3用量對(duì)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色效果的影響Fig.1 Effect of 12%Na2CO3on the color effect of the standard solution of the gallic acid

由圖1可見(jiàn)，吸光度隨著12%Na2CO3用量的增加而增加，12%Na2CO3用量增加到2.0 mL時(shí)，吸光度最大，此時(shí)12%Na2CO3溶液的用量與福林-酚試劑的用量的體積比為2∶1，繼續(xù)增加12%Na2CO3的用量，吸光度略有下降最終趨于平緩，所以可以認(rèn)為當(dāng)12%Na2CO3溶液的用量與福林-酚試劑的用量體積比為2∶1時(shí)，顯色比較完全。

2.1.2 福林-酚試劑用量的確定

堿性溶液中，北冰紅山葡萄中的多酚類化合物被福林酚試劑中的鎢鉬酸定量氧化，自身被還原生成藍(lán)色化合物，底物顯色的完全與否與福林-酚試劑的用量有直接關(guān)系，若用量不足，會(huì)導(dǎo)致顯色不完全。福林-酚試劑對(duì)反應(yīng)顯色效果的影響如圖2所示。

圖2 福林-酚試劑用量對(duì)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色效果的影響Fig.2 Effect of Folin-phenol on the color effect of the standard solution of the gallic acid

由圖2可見(jiàn)，吸光度隨福林-酚試劑用量的增加而增加，當(dāng)用量增加到4 mL時(shí)吸光度趨于平穩(wěn)，因此當(dāng)福林-酚與反應(yīng)液的體積比為4∶1時(shí)，顯色較為完全。

2.2 顯色溫度的確定

溫度極易影響多酚物質(zhì)自身結(jié)構(gòu)，多酚物質(zhì)在較高的溫度體系里極易分解，若溫度較低，也會(huì)影響酚類物質(zhì)與福林-酚試劑的反應(yīng)情況，并且不同物質(zhì)所含的多酚種類和數(shù)量不一樣，所以應(yīng)針對(duì)樣品確定相應(yīng)的顯色溫度。溫度對(duì)顯色效果的影響如圖3所示。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)樣品顯色效果的影響Fig.3 The influence of reaction temperature on the color efficiency for specimen

由圖3可見(jiàn)，在較低的溫度條件下，吸光度較小，說(shuō)明此時(shí)反應(yīng)緩慢，低溫抑制了酚類物質(zhì)與福林-酚試劑的反應(yīng)，隨著反應(yīng)溫度的增加，吸光度不斷增加，說(shuō)明此時(shí)該反應(yīng)不再受溫度的抑制，當(dāng)溫度為20℃時(shí)，吸光度最大，當(dāng)溫度大于20℃時(shí)，吸光度逐漸降低，說(shuō)明此時(shí)多酚物質(zhì)受溫度的影響已經(jīng)分解。因此該反應(yīng)的最佳溫度為20℃。

2.3 顯色時(shí)間的確定

多酚物質(zhì)的顯色需要一定時(shí)間，多酚物質(zhì)反應(yīng)是否完全與反應(yīng)時(shí)間有直接關(guān)系，反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色程度的影響如圖4示。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)樣品顯色效果的影響Fig.4 The influence of reaction time on the color efficiency for specimen

由圖4可見(jiàn)，在4 h以內(nèi)顯色不完全，隨時(shí)間增加，吸光度明顯增加，4 h時(shí)達(dá)到最大，4小時(shí)后隨時(shí)間的增加吸光度趨于平穩(wěn)，在誤差范圍內(nèi)差異不顯著，即可以認(rèn)為反應(yīng)時(shí)間為4 h時(shí)，顯色完全。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及樣品的測(cè)定

總多酚測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。

圖5 北冰紅總多酚測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve for the total polyphenol determination of Vitis amurensis Rupr（Beibinghong）

線性關(guān)系為y=6.850x-0.076，R2=0.9994，線性良好。式中：y為沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，單位為mg/L，x為吸光度。在測(cè)量樣品中多酚含量時(shí)，在相同的反應(yīng)條件下測(cè)定樣品的吸光度，通過(guò)公式算出樣品溶液中多酚的濃度，計(jì)算樣品中多酚含量。

式中：W為北冰紅葡萄樣品中總多酚的含量，mg/g；C為沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mg/L；V為提取液體積，mL；N反應(yīng)液體積，mL；M為每次處理樣品的質(zhì)量，g。

按標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法分別測(cè)定不同日期的北冰紅溶液（1.0 mL），通過(guò)公式計(jì)算出沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，分別計(jì)算出樣品北冰紅葡萄中的多酚含量，其變化規(guī)律見(jiàn)圖6。

圖6 北冰紅轉(zhuǎn)色至冰凍時(shí)期總酚含量的變化趨勢(shì)Fig.6 Variation tendency of total phenols content of Vitis amurensis Rupr（Beibinghong）coloring and frost period

由圖6可見(jiàn)，總酚含量在2016年8月17日時(shí)為0.437 mg/g，隨后呈現(xiàn)逐步上升的趨勢(shì)，在10月21日多酚含量達(dá)到最高（1.622 mg/g），然后逐漸降低，11月30日采摘日時(shí)總酚含量降至1.105 mg/g。整體來(lái)說(shuō)，在北冰紅轉(zhuǎn)色至冰凍期，總酚含量呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，在成熟末期總酚含量達(dá)到最高。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是在轉(zhuǎn)色至成熟期，北冰紅山葡萄不斷生長(zhǎng)，酚類物質(zhì)的合成速率大于其分解速率，因此總酚含量逐漸增加。而成熟至冰凍期，北冰紅山葡萄停止生長(zhǎng)，無(wú)生命體征，但是依然進(jìn)行呼吸作用等活動(dòng)，導(dǎo)致酚類物質(zhì)的分解速率大于合成速率，因此總酚含量逐漸降低。而李阿英等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中白藜蘆醇含量呈先逐漸增長(zhǎng)達(dá)到峰值后逐漸下降的趨勢(shì)，并且王美麗等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在不同葡萄漿果成熟過(guò)程中，沒(méi)食子酸、兒茶素、丁香酸等酚類物質(zhì)的變化規(guī)律都不相同。因此其總酚的變化規(guī)律也不一定是單一的逐漸增加或降低，所以影響北冰紅總酚含量變化的因素有很多種，還有待進(jìn)一步研究。

2.5 分析方法的評(píng)價(jià)

2.5.1 精密度試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，通過(guò)表1可知，該方法精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)Table 1 Precision experiment

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)見(jiàn)表2。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)Table 2 Repetitive experiment

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性試驗(yàn)見(jiàn)表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 3 Stability experiment

由表3可知，該分析方法穩(wěn)定性良好。

2.5.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

加標(biāo)回收試驗(yàn)見(jiàn)表4。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)Table 4 Average spiked recovery of total polyphenols experiment

從表4可以看出各組的加標(biāo)回收率都在99%以上，RSD為1.03%，則說(shuō)明該分析方法準(zhǔn)確可靠，可用于北冰紅葡萄果實(shí)總多酚含量的測(cè)定。

3 結(jié)論

福林-酚比色法測(cè)定北冰紅葡萄總酚含量的最佳條件為：樣品∶福林-酚試劑∶12%（質(zhì)量比）Na2CO3溶液=1∶4∶8（體積比），溫度 20℃，反應(yīng) 4 h，測(cè)定方法的平均回收率為99.91%，RSD為1.03%。該方法適合北冰紅葡萄樣品總多酚含量的測(cè)定。

用福林-酚比色法分別測(cè)定不同時(shí)期的北冰紅山葡萄果實(shí)中的總酚含量，可知隨著葡萄果實(shí)的發(fā)育，總多酚的含量逐漸增加，直至10月21日（1.622 mg/g）左右達(dá)到最大，從10月21日至11月30日總多酚的含量逐漸降低，但降幅不明顯。

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