余明霞， 蔡 慧， 陳 豪， 喻勇新,2， 潘迎捷,2， 王永杰,2*

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.農(nóng)業(yè)部 水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海 201306)

諾如病毒(Norovirus, NoV)屬于杯狀病毒科(Caliciviridae)諾如病毒屬(Norovirus)，舊名“諾瓦克樣病毒”或“小圓結(jié)構(gòu)病毒”，可導(dǎo)致人和動(dòng)物的非細(xì)菌性急性腸胃炎[1]NoV的“爆發(fā)”也是近年導(dǎo)致發(fā)達(dá)國家非細(xì)菌性腹瀉發(fā)病率持續(xù)上升的重要原因之一[2]，是人類健康的主要威脅[3]。研究表明，在牡蠣的組織中發(fā)現(xiàn)了NoV的特異性配體，并協(xié)助牡蠣特異性的富集NoV[4]，進(jìn)一步驗(yàn)證了牡蠣有可能是NoV在環(huán)境中傳播的重要載體。由于NoV不能在體外高效增殖[5]，表達(dá)帶有與受體結(jié)合位點(diǎn)的蛋白成為目前NoV免疫學(xué)研究的主要途徑。NoV是單股正鏈的RNA病毒，無囊膜，直徑27～32 nm。基因組全長(zhǎng)約7 500 nt，包含3個(gè)開放閱讀框(Open Reading Frames, ORFs)，即ORF1、ORF2(VP1)、ORF3(VP2)[6]。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2和ORF3分別編碼主要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白。ORF2能通過真核表達(dá)系統(tǒng)獲得病毒樣顆粒(Virus-like particle，VLP)，VLP與NoV有相同的抗原類型和結(jié)合位點(diǎn)，在一定程度上可以代替NoV在體外進(jìn)行病毒感染機(jī)制和免疫學(xué)研究[7-8]。相較于原核表達(dá)系統(tǒng)，真核表達(dá)系統(tǒng)耗時(shí)長(zhǎng)，耗資大。然而ORF2難以在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。ORF2可分為S(Shell)區(qū)和P(Protruding)區(qū)，P區(qū)可在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)獲得P粒子。P粒子作為NoV的亞基粒子，與VLP顯示相同的抗原類型，且該粒子與HBGAs受體(Histo-blood group antigens)結(jié)合的模式與VLP相同[7]。此外，P粒子具有高度穩(wěn)定性和高免疫原性，能夠在大腸埃希菌中高效表達(dá)[9-10]。本研究開展了NoV GII.6 P粒子的原核表達(dá)與純化工作，為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 含GII.6 NoV的糞便樣品，由中國疾病預(yù)防與控制中心提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備 AKTA-pure蛋白純化儀(GE)，小型高速冷凍離心機(jī)(eppendorf，5417R)，高速冷凍離心機(jī)(HITACHI，CR 21GIII)，PCR儀(eppendorf，vapo.protect)；GSTrap FF1×5 mL(GE，17-5131-01)，0.22 μm濾器和0.45 μm濾器(Millipore)，PVDF膜(Millipore)。

1.1.3 試劑 RNA提取試劑盒(捷瑞，GK3015)，LB固體培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基(北京陸橋)，T載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒(生工，SK2211)，蛋白上樣緩沖液(生工，C508319-0001)，DNA分子標(biāo)尺(天根)，克隆菌株TOP10(天根，CB104)，表達(dá)菌株BL21(microgene，CH5003A)，表達(dá)菌株Rosetta(microgene，CH5003B)，表達(dá)菌株OrigamiB(microgene，CH5003F)，PCR Mix(TaKaRa，RR901A)，非預(yù)染蛋白質(zhì)分子標(biāo)尺(TaKaRa，3597A)，BamH I(Thermo，ER0057)，SalI(Thermo，ER0641)，T4連接酶(Thermo，EL0014)，兔源GST-tag一抗(ABclonal，AE006)，抗兔二抗(堿性磷酸酶標(biāo)記)(ABclonal，AS009)，預(yù)染蛋白質(zhì)分子標(biāo)尺(Thermo，26616)，BCA法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(生工，C503021)，考馬斯亮藍(lán)R-250(Ourchem，6104-59-2)，還原型谷胱甘肽(amresco，70-18-8)。溶菌酶、過硫酸銨、β-巰基乙醇、TEMED、甘油、Tween-20、30%聚丙烯酰胺、苯甲基磺酰(PMSF)、BCIP/NBT顯色液、氯化鈉、氯化鉀、十二烷基硫酸鈉、脫脂奶粉均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；N-N二甲基甲酰、氯化硝基四氮唑、5-溴-4-氯-3吲哚磷酸酯對(duì)甲苯胺鹽、甲醇、冰乙酸、甘氨酸、尿素均購自上海國藥集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 克隆 糞便樣品按照10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))重懸于1×PBS(pH 7.3)中，每管100 μL,-80 ℃保存。病毒RNA利用RNA提取試劑盒從100 μL糞便重懸的上清中提取，最終總RNA洗脫于35 μL 經(jīng)DEPC處理的水中。利用嵌套式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(nest reverse transcription polymerase chain reaction, Nest RT-PCR)[11-12]，從糞便樣品中篩出GII.6陽性樣品。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)的NoV GII.6 VP1序列，根據(jù)這些參考序列設(shè)計(jì)GII.6 VP1的引物，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)從GII.6陽性樣品中獲得GII.6 VP1的序列，經(jīng)TA克隆至pUCm-T載體上進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保獲得的序列是GII.6 的VP1序列。根據(jù)GII.6 VP1的序列，設(shè)計(jì)P區(qū)的表達(dá)引物，將BamH I和SalI這兩種酶的酶切位點(diǎn)分別加在正反引物的5′端(斜體)，在反向引物的5′端分別加上半胱氨酸(粗體)和終止密碼子(下劃線)，并在正反引物的5′端酶切位點(diǎn)的前面分別加上對(duì)應(yīng)的保護(hù)堿基(見表1)。通過PCR將P區(qū)序列從無突變的pUCm-T-GII.6 VP1擴(kuò)增下來，經(jīng)BamH I和SalI雙酶切并純化回收后，連接到同樣經(jīng)BamH I和SalI雙酶切過的表達(dá)載體pGEX-4T-1上。轉(zhuǎn)化到克隆菌株TOP10中，37 ℃，200 r/min過夜培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-GII.6P，測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與pUCm-T-GII.6 VP1進(jìn)行比對(duì)，確定所獲得的P區(qū)表達(dá)序列沒有突變。GII.6 P序列確認(rèn)無誤后，利用在線軟件ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)P粒子的大小，作為驗(yàn)證表達(dá)的參考依據(jù)。并利用在線軟件NCBI ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) 對(duì)表達(dá)載體pGEX-4T-1-GII.6 P進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)，判斷目的蛋白表達(dá)斷裂的可能性。

1.2.2 蛋白表達(dá) 將pGEX-4T-1-GII.6 P轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21中，挑取單克隆菌株置于LB(Amp+：100 mg/L)液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min過夜擴(kuò)增培養(yǎng)后，按照1∶100的比例接種至LB(Amp+)液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)3～4 h，至OD600值為0.5～0.7，加入1×10-3mol/L的 IPTG,在22 ℃、200 r/min下誘導(dǎo)培養(yǎng)22 h，12 000 r/min離心30 min收集菌體。將收集到的菌體重懸于含5%甘油的1×PBS(pH 7.3)中，加入蛋白酶抑制劑，置于-20 ℃冰箱中冷凍1.5 h后取出，置于室溫融化后，加入溶菌酶(20 mg/mL)于37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)30 min。取出置于冰上超聲(350 W,超聲時(shí)間為3 s，間隔4 s，循環(huán)80次)破碎，至菌液透亮。12 000 r/min、離心30 min，分離上清與沉淀。利用SDS-PAGE和Western blot分別對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行定性和定量分析，驗(yàn)證目的蛋白是否表達(dá)，并確定目的蛋白的表達(dá)量。

表1 引物列表Table 1 Primers used in this study

注：“1”表示引物5′端在序列X86557上的位置；“2”表示引物5′端在序列KC576910上的位置

表2 表達(dá)優(yōu)化方案Table 2 The strategy of expression optimization

1.2.3 蛋白表達(dá)的條件優(yōu)化 具體優(yōu)化方案如表2所示。根據(jù)文獻(xiàn)中誘導(dǎo)劑IPTG的參考值，設(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)的濃度梯度，再分別對(duì)表達(dá)菌株、表達(dá)時(shí)間和表達(dá)溫度同時(shí)進(jìn)行優(yōu)化。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置2個(gè)平行，未誘導(dǎo)組不加誘導(dǎo)劑，其他條件同誘導(dǎo)組。

1.2.4 蛋白純化條件的優(yōu)化 將上清置于冰上，用1×PBS(pH 7.3)將AKTA-pure系統(tǒng)平衡好后，上樣并收集流穿液。然后用還原型谷胱甘肽進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫產(chǎn)物。用SDS-PAGE驗(yàn)證流穿液和洗脫產(chǎn)物，確定目的蛋白是否掛柱，并確定能否被還原型谷胱甘肽洗脫下來以及還原型谷胱甘肽的具體洗脫濃度。根據(jù)SDS-PAGE和Western blot的結(jié)果，分別從清洗純化柱的試劑、清洗濃度、洗脫濃度、上樣速度和增加純化步驟等方面，對(duì)純化條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

通過RT-PCR，利用引物GII.6 VF和GII.6 VR(表1)從RNA樣品中擴(kuò)增出GII.6 VP1，電泳條帶與目的產(chǎn)物大小吻合，如圖1(a)中GII.6 VP1所示。由于需對(duì)GII.6 VP1測(cè)序驗(yàn)證，故選取克隆重組質(zhì)粒pUCm-T-GII.6 VP1進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，pUCm-T-GII.6 VP1的電泳結(jié)果與預(yù)測(cè)大小一致，如圖1(a)中GII.6 VP1重組質(zhì)粒所示。根據(jù)獲得的GII.6 VP1序列，設(shè)計(jì)了表達(dá)引物GII.6 PF和GII.6 PR，并利用表達(dá)引物通過PCR從pUCm-T-GII.6 VP1上擴(kuò)增出帶有酶切位點(diǎn)和半胱氨酸的插入序列，大小為993 bp(GII.6)+10 bp(GII.6 PF)+40 bp(GII.6 PR)=1 043 bp，與電泳結(jié)果一致，如圖1(a)中表達(dá)片段所示。將表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1(如圖1(a)中表達(dá)載體所示)和GII.6 P表達(dá)序列經(jīng)雙酶切后，通過克隆，最后提取質(zhì)粒測(cè)序，表達(dá)質(zhì)粒預(yù)測(cè)大小與電泳結(jié)果一致，如圖1(a)中表達(dá)質(zhì)粒所示。通過比對(duì)最終的GII.6 P表達(dá)序列與最初的GII.6 VP1序列可知，二者的相似性為100%，表達(dá)載體pGEX-4T-1-GII.6 P構(gòu)建成功。

圖1 GII.6 P粒子的表達(dá)Fig.1 GII.6 P particle expression(a)重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-GII.6 P的構(gòu)建；(b)表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-GII.6 P的ORF預(yù)測(cè)結(jié)果：圖中灰色標(biāo)注部分分別是GST標(biāo)簽和GII.6 P，黑色加粗部分為ORF預(yù)測(cè)結(jié)果；(c)GII.6 P粒子的表達(dá)驗(yàn)證及表達(dá)條件的優(yōu)化結(jié)果：圖中箭頭所指為目的蛋白條帶位置(a) The recombination of expression plasmid pGEX-4T-1-GII.6 P； (b) ORF finder of pGEX-4T-1-GII.6 P: the grey marked part of GST tag and GII. 6 P, black bold marked ORF prediction result； (c) The results of expression checking and optimization: arrow in the figure presented the target protein bands

2.2 表達(dá)產(chǎn)物大小預(yù)測(cè)和ORF預(yù)測(cè)

在線蛋白大小預(yù)測(cè)軟件ExPASy結(jié)果顯示，GII.6 P表達(dá)產(chǎn)物的大小約為36.34 kDa。查閱文獻(xiàn)可知，GST-tag蛋白的大小為26 kDa，所以融合蛋白的大小約為62 kDa。圖1(b)中，灰色注釋的序列分別是GST標(biāo)簽和插入GII.6 P片段，黑色加粗的序列是ORF預(yù)測(cè)的結(jié)果。ORF預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-GII.6 P在表達(dá)過程中，融合蛋白出現(xiàn)表達(dá)斷裂的機(jī)會(huì)比較小。

2.3 表達(dá)驗(yàn)證和表達(dá)優(yōu)化的結(jié)果

圖1(c)中，每孔上樣量均為37.5 μL表達(dá)菌液的產(chǎn)物，所以每個(gè)點(diǎn)樣孔之間都存在可比性，圖1(c)中，上半部分是SDS的結(jié)果，下半部分是Western-blot的結(jié)果。對(duì)比誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組的Western-blot結(jié)果，可以得出結(jié)論：GII.6 P粒子表達(dá)成功，并且是以可溶性蛋白的形式表達(dá)。比較上清和沉淀中目的蛋白的含量，發(fā)現(xiàn)沉淀中依然存在大量的目的蛋白，故分別從表達(dá)菌株、表達(dá)時(shí)間、表達(dá)載體、表達(dá)溫度和誘導(dǎo)劑的濃度等項(xiàng)目，對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期從上清中獲得更多的目的蛋白。首先，根據(jù)SDS-PAGE膠圖結(jié)果，優(yōu)化誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)濃度，根據(jù)文獻(xiàn)中誘導(dǎo)劑IPTG的參考值，設(shè)計(jì)的對(duì)應(yīng)濃度梯度為1.5×10-3、1.0×10-3、8×10-4、5×10-4、4×10-4、2×10-4、5×10-5mol/L，最終確定的誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為2×10-4mol/L。在此基礎(chǔ)上，通過比較每一個(gè)表達(dá)產(chǎn)物的上清中目的蛋白的含量，確定最終的表達(dá)條件。其次，基于表達(dá)菌株的比較，待選表達(dá)菌株有BL21、Rosetta和OrigamiB，BL21和Rosetta表達(dá)的上清中目的蛋白含量均高于OrigamiB，這兩者間沒有明顯的區(qū)別，上清中目的蛋白的含量基本相同，最終根據(jù)文獻(xiàn)[19]，選擇BL21作為表達(dá)菌株。同時(shí)，將表達(dá)溫度分別設(shè)定為16、22 和37 ℃，其中，最終通過比較表達(dá)上清中目的蛋白的含量決定最適表達(dá)溫度，14 ℃ 表達(dá)產(chǎn)物的上清中目的蛋白總體低于22 ℃ 和37 ℃ 下的誘導(dǎo)產(chǎn)物，且14 ℃ 和37 ℃ 表達(dá)產(chǎn)物中目的蛋白主要存在于沉淀中，所以表達(dá)溫度最終定為22 ℃ 。從誘導(dǎo)后2～26 h，4 h為一個(gè)梯度進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，停止表達(dá)后需立即離心收集表達(dá)產(chǎn)物。SDS-PAGE膠圖結(jié)果顯示，上清中目的蛋白的含量隨表達(dá)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但是誘導(dǎo)22 h后，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，上清中目的蛋白的含量有減少的趨勢(shì)，所以表達(dá)時(shí)間最終定為22 h。優(yōu)化后的表達(dá)條件為誘導(dǎo)劑濃度2×10-4mol/L,表達(dá)菌株為BL21，表達(dá)溫度為22 ℃，表達(dá)時(shí)間為22 h。

2.4 蛋白純化驗(yàn)證和純化優(yōu)化的結(jié)果

由圖2結(jié)果顯示，目的蛋白能掛柱，并且能被1×10-2mol/L還原型谷胱甘肽洗脫。在此基礎(chǔ)上，對(duì)純化條件做以下優(yōu)化：降低上樣速度(最大化樣品掛柱效率)、上樣后利用還原劑清洗親和柱(在確保不影響目的蛋白的前提下，盡可能多地去掉雜蛋白)、結(jié)合多種純化方法(獲得純度較高的目的蛋白)。

本研究中，對(duì)于500 mL培養(yǎng)液離心后的菌體裂解液，通過比較流穿液的Western-blot結(jié)果，發(fā)現(xiàn)上樣流速不超過1 mL/min時(shí)，流穿液中沒有目的蛋白。上樣后，分別用DTT、尿素和1‰ Triton 100清洗標(biāo)簽柱中的雜蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示DTT清洗雜蛋白的能力最好。親和純化主要作用是最大限度地捕獲目的蛋白。為了進(jìn)一步得到純度更高的蛋白，在親和純化的基礎(chǔ)上，結(jié)合陰離子交換和凝膠過濾層析，最終獲得純度大于90%的目的蛋白，結(jié)果如圖3所示。

圖3 蛋白純化條件優(yōu)化的結(jié)果Fig.3 Purification verification

3 討 論

牡蠣是濾食性生物，組織中有NoV特異性的配體，富集NoV的能力較強(qiáng)，食用被污染的牡蠣是近年來NoV爆發(fā)的原因之一[20]。鑒于牡蠣作為NoV在環(huán)境中傳播的主要載體[21-24]，對(duì)于牡蠣富集NoV的機(jī)理研究顯得尤為重要。最新研究結(jié)果表明[25-26]，NoV能夠在B細(xì)胞和腸道細(xì)胞中增殖，但不穩(wěn)定，因此難以獲得足夠的病毒顆粒用于探索NoV的傳播與富集。研究證實(shí)NoV P粒子具有與病毒相似的抗原特性，使得進(jìn)一步的研究成為可能。

本研究對(duì)NoV P粒子表達(dá)的優(yōu)化結(jié)果與前人研究基本相同[12-13，19，27]，在選取表達(dá)菌株的時(shí)候，考慮到GII.6 P的序列中含有大腸埃希菌稀有密碼子，Rosetta菌株能夠補(bǔ)充大腸埃希菌缺乏的 6 種稀有密碼子(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA)對(duì)應(yīng)的 tRNA，從而提高外源基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平；由于本研究最終是為了獲得更多有活性的GII.6 P粒子，而OrigamiB菌株包含突變的硫氧還原蛋白酶和谷胱甘肽還原酶基因，可以表達(dá)主要還原途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶，有利于形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白，增強(qiáng)蛋白可溶性；至于BL21則是引自NoV P粒子表達(dá)的相關(guān)文獻(xiàn)[19]。經(jīng)過本研究的驗(yàn)證可以進(jìn)一步證明，這個(gè)表達(dá)系統(tǒng)基本適用于NoV P粒子的表達(dá)，針對(duì)不同基因型P粒子的表達(dá)，僅需對(duì)IPTG的濃度進(jìn)行優(yōu)化即可。

本研究對(duì)NoV P粒子的純化條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，根據(jù)首次純化產(chǎn)物的SDS-PAGE膠圖結(jié)果，首先對(duì)上樣速度進(jìn)行了優(yōu)化，從而保證盡可能多地捕獲目的蛋白，最終上樣速度確定為0.5 mL/min。在此基礎(chǔ)上，盡可能多地去除雜蛋白。對(duì)于雜蛋白的去除，首先采取的方法是在親和純化的基礎(chǔ)上引入還原劑，上樣后，優(yōu)化還原劑的濃度和類型來清洗親和柱，根據(jù)親和純化的結(jié)果可知，僅僅基于親和純化是無法去除雜蛋白的。然而分析親和純化的結(jié)果可知，雜蛋白主要集中在25～50 kDa，與目的蛋白GII.6 P粒子(62 kDa)的大小差距不大，無法直接利用凝膠過濾層析除去。另外，由于未知蛋白GII.6 P粒子的等電點(diǎn)不詳，無法根據(jù)GII.6 P粒子的特性來選擇蛋白純化工序，只能根據(jù)GST標(biāo)簽來間接純化GII.6 P粒子。

由于GST標(biāo)簽可以與陰離子交換柱結(jié)合，因此在親和純化的下游選擇了陰離子交換。經(jīng)過對(duì)陰離子交換純化條件的優(yōu)化，最終成功除去了部分位于25～50 kDa區(qū)間的雜蛋白，通過分析陰離子交換蛋白純化的結(jié)果可知，僅剩下三個(gè)主要雜蛋白帶：近180 kDa、近44.3 kDa和近25 kDa，而目的蛋白GII.6 P粒子(62 kDa)的大小與近180 kDa和近25 kDa之間的差距較大(>25)，故可嘗試?yán)媚z過濾層析去除這兩個(gè)雜蛋白帶。最終通過優(yōu)化凝膠過濾層析的條件，獲得了純度較高的GII.6 P粒子。

本研究構(gòu)建了NoV P粒子的原核表達(dá)及純化體系，提供了獲得NoV P粒子的詳細(xì)步驟以及蛋白表達(dá)和純化的優(yōu)化方案。與此同時(shí)，通過原核表達(dá)得到了大批量、高純度的GII.6 P粒子，為下一步的多克隆抗體制備提供充足的合格抗原，進(jìn)而為后續(xù)牡蠣富集NoV的機(jī)理研究提供了實(shí)驗(yàn)材料。

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