王升厚， 牛世莉， 徐方旭， 王 澤， 柳葉飛

(1.沈陽師范大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)又名北蟲草，是蟲草屬模式種之一，在遼寧省栽培規(guī)模極大，每年生產(chǎn)干品約6 000 t，成為區(qū)域特色經(jīng)濟(jì)的典型代表[1-2]。蛹蟲草的有效成分和保健價(jià)值早已在眾多文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)，但目前能夠檢測的成分種類還十分有限，主要集中在蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、腺苷、麥角甾醇、SOD酶等[3]。蛹蟲草子實(shí)體中是否含有其他生物活性成分或有價(jià)值的化學(xué)物質(zhì)，一直是蟲草行業(yè)和藥物研究人員希望解答的問題。2017年10月19日，《細(xì)胞》雜志子刊《Cell Chemical Biology》在線發(fā)表了中國科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所王成樹老師研究團(tuán)隊(duì)的最新研究成果，揭示了蟲草素伴隨保護(hù)分子噴司他丁的生物合成途徑[4]。這一發(fā)現(xiàn)表明在蛹蟲草中的確存在著重要的天然化合物需要進(jìn)一步發(fā)掘，同時(shí)也說明我們對(duì)蛹蟲草的成分認(rèn)知和保健價(jià)值認(rèn)識(shí)還有待提高。代謝組學(xué)是一門研究生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的種類、數(shù)量及其在內(nèi)外因素影響下變化規(guī)律的學(xué)科，是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后誕生的一門新的交叉學(xué)科，它是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，近年來已經(jīng)迅速成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[5-7]。代謝組學(xué)通過高通量、高分辨率的分析技術(shù)，結(jié)合模式識(shí)別、專家系統(tǒng)等分析方法，從整體上探討生命活動(dòng)在代謝層面的特征和規(guī)律，是目前發(fā)現(xiàn)潛在活性成分的最佳方法之一[8-10]。鑒于代謝組學(xué)技術(shù)在生物樣本成分體系分析中的優(yōu)勢，本課題組委托北京邦菲生物科技有限公司，對(duì)供試的不同類別蟲草或不同來源蛹蟲草共4個(gè)樣品進(jìn)行了非靶向成分體系初步分析，重點(diǎn)研究了功能性蛹蟲草、野生蛹蟲草、柞蠶蛹蟲草和冬蟲夏草(Cordycepssinensis)在代謝組學(xué)層面的成分差異。功能性蛹蟲草概念是沈陽師范大學(xué)蛹蟲草研究團(tuán)隊(duì)2008年提出的，它是以成分指標(biāo)作為蛹蟲草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)價(jià)體系，2016年獲得發(fā)明專利《一種功能性蛹蟲草的培育方法》授權(quán)。由于功能性蛹蟲草人工培育中需要采用特殊的菌種，獨(dú)特的培養(yǎng)基配方，以及仿野生的栽培條件，因此所培育的蛹蟲草子實(shí)體內(nèi)蟲草素含量可以達(dá)到很高水平。然而除此之外是否還含有其他有價(jià)值的代謝產(chǎn)物，特別是生物活性成分一直是關(guān)注的重點(diǎn)。本研究是基于上述目標(biāo)實(shí)施的初步探索，以期為功能性蛹蟲草的基礎(chǔ)研究和產(chǎn)業(yè)開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 采用實(shí)驗(yàn)室栽培的功能性蛹蟲草為研究對(duì)象，以柞蠶蛹蟲草、野生蛹蟲草及冬蟲夏草為對(duì)照進(jìn)行代謝組學(xué)分析。供試樣品的具體信息見表1。

1.1.2 主要試劑 甲醇(Fisher Scientific，LC-MS級(jí))。

1.1.3 主要儀器 超高效液相系統(tǒng)(ACQUITY UPLC I-Class，美國Waters公司)，質(zhì)譜儀(Waters SYNAPT G2-S)，高通量組織研磨儀(Coyote-Bio G100)。

1.1.4 分析軟件 代謝組學(xué)分析軟件ProgenesisTM QI及多元統(tǒng)計(jì)分析軟件EZ-info。

表1 供試樣品的相關(guān)信息Table 1 Relevant information of the samples

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 各樣本分別稱取200 mg，破碎后溶于900 μL 75%甲醇浸提過夜，離心，取上清-20 ℃保存，代謝組學(xué)檢測備用。取200 g功能性蛹蟲草干品送廣州分析測試中心備檢。

1.2.2 代謝組學(xué)檢測 由北京邦菲生物科技有限公司執(zhí)行。色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，柱溫40 ℃，樣品溫度10 ℃，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，B為0.1%甲酸乙腈，進(jìn)樣量1 μL，體積流量0.50 mL/min，梯度洗脫 0～3 min，1%→5%B；3～12 min，5%→60%B；12～15 min，60%→99%B；15～17 min，99%B。質(zhì)譜條件：采集質(zhì)量范圍為100～1 500 Da，掃描時(shí)間為0.1 s，采集模式為ESI-ESI+MSE，Lock mass：Glu-fibrinopeptide(0.3 s掃描，間隔：15 s)，毛細(xì)管電壓：3 kV(ESI+)/ 2.5 kV(ESI-)；錐孔電壓：100 V；碰撞能量(eV)：low CE：6 / High CE：20～45；電離源溫度：120 ℃；脫溶劑溫度：500 ℃；錐孔氣流速：60 L/h。

1.2.3 主要生物活性物質(zhì)的定量檢測 由廣州分析測試中心檢測，檢測方法執(zhí)行國標(biāo)或部標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝物聚類分析

通過熱圖對(duì)各蟲草樣品間代謝物的差異情況進(jìn)行分析。由圖1可以看出，冬蟲夏草和柞蠶蛹蟲草代謝產(chǎn)物的種類和表達(dá)量較為接近，其次是野生蛹蟲草與這二者接近。而功能性蛹蟲草與這三種蟲草之間差異最為顯著，表現(xiàn)為代謝產(chǎn)物種類豐富度更高，表達(dá)量更高。這是因?yàn)槎x夏草、柞蠶蛹蟲草和野生蛹蟲草雖然寄主互不相同，但都是以高蛋白質(zhì)、高脂肪的昆蟲幼蟲或蛹體為培養(yǎng)基質(zhì)，在生活方式上都是先行寄生，后轉(zhuǎn)為腐生，因此，在代謝產(chǎn)物種類和表達(dá)量上才會(huì)比較接近。功能性蛹蟲草由于栽培基質(zhì)主要是小麥和柞蠶蛹漿，從營養(yǎng)角度講碳源和氮源搭配合理、營養(yǎng)全面，因此其代謝產(chǎn)物種類豐富度才會(huì)更高，表達(dá)量更高，與其他三者差異更為顯著。此外后者的全程腐生方式，可能也是原因之一，因?yàn)楦欣谂囵B(yǎng)基質(zhì)的充分分解和代謝產(chǎn)物的合成。

圖1 4種蟲草代謝產(chǎn)物的聚類分析Fig.1 Four Chinese caterpillar fungus metabolites of cluster analysis

頂端為代謝產(chǎn)物的聚類，橫坐標(biāo)表示供試樣品編號(hào)，縱坐標(biāo)表示所有檢測物質(zhì)的分子量/出峰時(shí)間；紅色代表高表達(dá)，綠色代表低表達(dá)

The top is the cluster of metabolites, the horizontal coordinates represent the sample number of the sample, and the vertical coordinate represents the molecular weight/peak time of all the detected substances; Red represents high expression and green represents low expression

2.2 供試蟲草成分種類的分析

4種供試蟲草中成分總計(jì)3 045種，不同種類蟲草在代謝產(chǎn)物成分種類上存在明顯的差異。如圖2所示，功能性蛹蟲草共檢測出產(chǎn)物成分2 213種，占成分總量的72.67%，其特有成分497種；柞蠶蛹蟲草共檢出產(chǎn)物成分1 857種，占成分總量的60.98%,特有成分279種；野生蛹蟲草共檢出產(chǎn)物成分1 428種，占成分總量的46.89%，特有成分167種；冬蟲夏草共檢出產(chǎn)物成分1 024種，占成分總量的33.62%，特有成分108種。供試4種樣品全部成分統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明功能性蛹蟲草代謝產(chǎn)物種類最多，而且特有成分?jǐn)?shù)量也最為豐富。

圖2 供試蟲草成分種類的分析Fig.2 Selected Chinese caterpillar fungus species of analysis

2.3 功能性蛹蟲草部分漢化產(chǎn)物歸類分析

目前大量代謝產(chǎn)物成分尚在解析之中，對(duì)目前已經(jīng)漢化的835種已知成分進(jìn)行歸類分析(表2)，結(jié)果表明，835種成分分別隸屬于12個(gè)不同的物質(zhì)類別，其中糖苷類、皂苷類和生物堿類占比最高。

2.4 差異最顯著物質(zhì)分析

利用PLS-DA分析得到4種蟲草中VIP scores最高的15個(gè)差異代謝產(chǎn)物，見圖3、表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在VIP scores最高的15個(gè)差異代謝產(chǎn)物對(duì)比中，野生蛹蟲草表現(xiàn)出顯著的優(yōu)越性。

2.5 功能性蛹蟲草常見有效成分含量分析

功能性蛹蟲草常見有效成分的檢測委托中國廣州分析測試中心完成。表4中數(shù)據(jù)顯示，在已經(jīng)檢測的18項(xiàng)成分指標(biāo)中，蛹蟲草特有成分蟲草素含量為5 070 mg/kg，這個(gè)數(shù)值是目前沈陽地區(qū)普通小麥蛹蟲草含量均值的3倍。此外，麥角甾醇、SOD酶、維生素E含量分別是對(duì)照組的1.27倍、3.56倍和4.49倍。鋅和鐵兩種營養(yǎng)元素含量也分別是對(duì)照組的3.3倍和2.56倍。由于功能性蛹蟲草栽培中做了富硒處理，因此，子實(shí)體中硒含量達(dá)到了60.2mg/kg，是對(duì)照組的647倍?？拱┧幬锍煞謬娝舅∫苍诒緲悠纷詸z中獲得較高數(shù)據(jù)，其含量為60 mg/kg。本檢測對(duì)照組為普通小麥蛹蟲草(PTXMC)。

表2 功能性蛹蟲草成分歸類分析Table 2 Functional ingredients cordycepsmilitaris classified analysis

圖3 VIP scores分析Fig.3 VIP scores analysis

橫坐標(biāo)是VIP值，縱坐標(biāo)是代謝的mg/kg值，顏色由深綠到深紅表示各顯著代謝物的相對(duì)含量

The horizontal coordinate is the VIP value, and the ordinate is the value of mg/kg metabolism. The color is from dark green to deep red, indicating the relative content of each significant metabolite

表3 不同蟲草差異顯著化合物對(duì)比表Table 3 Different Chinese caterpillar fungus compounds significant difference contrast table

注：+的數(shù)量代表物質(zhì)的含量高低

表4 功能性蛹蟲草常見化學(xué)成分檢測結(jié)果Table 4 Functional cordycepsmilitaris common chemical composition test results

續(xù)表4

3 討 論

蟲草是我國傳統(tǒng)的中藥資源，特別是冬蟲夏草，因其應(yīng)用歷史悠久，文獻(xiàn)資料相對(duì)豐富。在古代醫(yī)書中對(duì)蟲草功效多這樣記載：補(bǔ)腎益肺、治諸虛百損、專補(bǔ)命門[11-12]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，蟲草主要是通過調(diào)節(jié)人體免疫體系，修復(fù)人體受損器官、組織和細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)古人對(duì)蟲草中醫(yī)理論的實(shí)現(xiàn)途徑[13-14]。成分決定功能，含量決定功效，任何一種蟲草要想發(fā)揮保健價(jià)值，一定在其子實(shí)體內(nèi)含有賴以發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[15]。本研究在代謝產(chǎn)物層面初步實(shí)現(xiàn)了對(duì)功能性蛹蟲草、冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草和野生蛹蟲草的成分認(rèn)知，從檢測數(shù)據(jù)分析看，功能性蛹蟲草共檢測出代謝產(chǎn)物成分2 213種，占成分總量的72.67%，其特有成分497種，與冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草和野生蛹蟲草相比具有顯著的成分優(yōu)勢。此外，除目前已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的部分成分外，還含有豐富的特殊性代謝產(chǎn)物，無論是哪種蟲草其代謝產(chǎn)物成分都十分豐富，但蛹蟲草成分豐富度更高些。然而，不同蟲草間成分的差異是否會(huì)直接導(dǎo)致蟲草間保健價(jià)值的不同，目前還沒有直接證據(jù)。另外，本研究主要是采用非靶向代謝組學(xué)分析方案，因此，很多成分表達(dá)量高低是相對(duì)的，如果針對(duì)某些重要產(chǎn)物感興趣，還必須開展靶向代謝組學(xué)分析進(jìn)行定量分析。

相對(duì)于代謝組學(xué)成分分析數(shù)據(jù)，傳統(tǒng)引用的蟲草標(biāo)志性成分顯然是冰山一角，因此試圖用一兩種已知成分解釋蟲草進(jìn)入人體后復(fù)雜多樣的生理反應(yīng)顯然不夠全面，這也是我們多年來一直主張采用全草入“藥”的原因所在。由于本代謝組學(xué)數(shù)據(jù)尚在整理之中，本文僅提供了部分比對(duì)數(shù)據(jù)，很多結(jié)論尚無法準(zhǔn)確給予。希望本研究能對(duì)后續(xù)的深入研究起到鋪墊和引導(dǎo)作用。

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