王 偉，杜曉寧，徐建飛，雷 雯

(上?；ぱ芯吭河邢薰?上海穩(wěn)定性同位素工程技術(shù)研究中心，上海 200062)

對甲氧基苯甲酸(p-methoxybenzoic acid)又稱對茴香酸、大茴香酸。穩(wěn)定同位素13C或D標(biāo)記對甲氧基苯甲酸是防腐劑、香料及藥物等穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)試劑的重要中間體。穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)試劑在食品安全檢測[1-2]、新藥篩選和復(fù)雜基質(zhì)中相關(guān)代謝物的定量分析中越來越受到關(guān)注[3-6]。如合成13C或D標(biāo)記3-氨基-4-甲氧基苯甲酸及對甲氧基苯甲酰氯，同時也可作為13C或D標(biāo)記茴拉西坦、乙胺磺膚酮等的醫(yī)藥中間體。

天然豐度對甲氧基苯甲酸的合成主要采用硫酸二甲酯與對羥基苯甲酸或?qū)追訛樵希趬A性條件下通過甲基化反應(yīng)獲得[1-2]，該方法因穩(wěn)定同位素標(biāo)記硫酸二甲酯合成難度較大而不適合穩(wěn)定同位素標(biāo)記對甲氧基苯甲酸的合成；也有研究者以對甲苯酚和碘甲烷為原料，利用相轉(zhuǎn)移催化法制備對甲氧基苯甲酸[3]，該方法反應(yīng)條件苛刻、后處理難度大。Wang等[4]以CD3I和對羥基苯甲酸為原料，經(jīng)雙甲基化、脫甲氧基(-CD3)后得到對甲氧基苯甲酸-D3，該工藝需要過量2倍(2 eq)的穩(wěn)定同位素原料，成本較高。Jemal等[5]以1.2 eq的CD3I和對羥基苯甲酸為原料，通過控制加入堿的量，選擇性合成對甲氧基苯甲酸-D3，但該工藝得到的產(chǎn)物中同時含有羥基位甲基化產(chǎn)物和羧基位甲基化產(chǎn)物，普通的純化過程難以獲得純度較高的對甲氧基苯甲酸-D3，上述2種工藝過程中，對羥基苯甲酸在堿性條件下首先與CD3I反應(yīng)生成對羥基苯甲酸甲酯-D3，再與過量的CD3I反應(yīng)生成對甲氧基苯甲酸甲酯-D3，最后通過脫-CD3基團(tuán)生成對甲氧基苯甲酸-D3，不僅成本較高，而且反應(yīng)過程易發(fā)生酯交換等副反應(yīng)。

本文以穩(wěn)定同位素13C或D標(biāo)記碘甲烷和尼泊金乙酯(對羥基苯甲酸乙酯)為原料，經(jīng)甲基化、堿解、重結(jié)晶后可得到純度較高的穩(wěn)定同位素標(biāo)記對甲氧基苯甲酸，該工藝路線簡便，甲氧基選擇性高，同位素利用率高，適于穩(wěn)定同位素13C或D標(biāo)記對甲氧基苯甲酸的合成。

1 主要儀器與試劑

RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市英峪高科儀器廠；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；島津2020型液質(zhì)聯(lián)用儀(LC-MS)：日本島津公司；精科WRS-2C型熔點(diǎn)儀：上海精密儀器儀表有限公司；JNM-ECZR核磁共振儀：日本電子株式會社(JEOL)。

碘甲烷-13C(13CH3I)：13C同位素豐度>99%，上?；ぱ芯吭河邢薰井a(chǎn)品；碘甲烷-D3(CD3I)：D同位素豐度>98.5%，上?；ぱ芯吭河邢薰井a(chǎn)品；碘甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、尼泊金乙酯、無水乙醇、乙酸乙酯、無水硫酸鎂等試劑均為市售分析純或化學(xué)純：國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，使用前均未進(jìn)一步純化。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 合成條件的選擇

采用單因素實(shí)驗(yàn)確定了穩(wěn)定同位素標(biāo)記對甲氧基苯甲酸合成工藝的反應(yīng)溫度、物料摩爾比及反應(yīng)時間。進(jìn)行工藝條件篩選時，為節(jié)省成本，采用的同位素原料實(shí)際為天然豐度原料。在后續(xù)用穩(wěn)定同位素13C或D標(biāo)記碘甲烷代替天然豐度碘甲烷時，對反應(yīng)的收率和同位素原料利用率的趨勢沒有影響。

2.2 對甲氧基苯甲酸-13C/D3的合成

對甲氧基苯甲酸-13C/D3的合成路線示于圖1。

圖1 對甲氧基苯甲酸-13C/D3的合成路線Fig.1 Synthetic route of [13C/D3] p-methoxybenzoic acid

在帶有磁力攪拌和溫度計的250 mL三口燒瓶中，N2保護(hù)下加入4.15 g(25 mmol)尼泊金乙酯、6.90 g(50 mmol)K2CO3、4.08 g(28.75 mmol)13CH3I，及50 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。磁力攪拌下將反應(yīng)液通過油浴鍋升溫至80 ℃，回流反應(yīng)6 h，趁熱過濾除去不溶物。向?yàn)V液中加入50 mL乙酸乙酯及20 mL鹽酸，萃取，合并有機(jī)相，無水硫酸鎂干燥，旋蒸濃縮后的產(chǎn)物可直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。

在帶有磁力攪拌和溫度計的250 mL三口燒瓶中，N2保護(hù)下加入上一步反應(yīng)產(chǎn)物、40 mL NaOH溶液，及10 mL無水乙醇，加熱回流2 h，冰水浴下，用2 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至1，析出白色固體，乙醇-水重結(jié)晶后得白色結(jié)晶產(chǎn)物，即為對甲氧基苯甲酸產(chǎn)品。產(chǎn)品經(jīng)干燥、稱重后得3.47 g白色結(jié)晶，收率為91.23%，純度為99.0%，碘甲烷利用率(同位素原料利用率)為79.33%，熔點(diǎn)為185.5～187.4 ℃。

3 結(jié)果與討論

3.1 合成條件

3.1.1反應(yīng)溫度

固定碘甲烷與尼泊金乙酯的摩爾比為n(碘甲烷)∶n(尼泊金乙酯)=1.15∶1，反應(yīng)時間為6 h，考察反應(yīng)溫度對同位素原料(碘甲烷)利用率的影響，結(jié)果示于圖2。由圖2可知，反應(yīng)溫度的變化對同位素原料利用率的影響較大，當(dāng)反應(yīng)溫度低于80 ℃時，隨反應(yīng)溫度升高，原料利用率逐漸升高；當(dāng)反應(yīng)溫度高于80 ℃時，易發(fā)生酯交換等副反應(yīng)，使原料利用率降低。因此，適合的反應(yīng)溫度為80 ℃。

圖2 反應(yīng)溫度對同位素原料利用率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on the utilization of isotope material

3.1.2物料摩爾比

由于穩(wěn)定同位素原料價格昂貴，為降低產(chǎn)品的開發(fā)成本，理論上應(yīng)使非同位素原料過量，但該反應(yīng)過程中，若使尼泊金乙酯過量，則容易發(fā)生酯交換副反應(yīng)，造成收率降低。因此，本文擬使碘甲烷過量，考察物料摩爾比對產(chǎn)物收率及碘甲烷利用率的影響。

固定反應(yīng)溫度為80 ℃，反應(yīng)時間為6 h，考察物料摩爾比n(碘甲烷)∶n(尼泊金乙酯)對產(chǎn)物收率及同位素原料利用率的影響，結(jié)果示于圖3。

由圖3數(shù)據(jù)可知，當(dāng)n(碘甲烷)∶n(尼泊金乙酯)=1∶1時，反應(yīng)收率及碘甲烷利用率均為65%，隨著碘甲烷加入量的增加，當(dāng)n(碘甲烷)∶n(尼泊金乙酯)>1.15∶1時，反應(yīng)收率基本維持不變，但碘甲烷利用率降低。因此，合適的物料摩爾比為n(碘甲烷)∶n(尼泊金乙酯)=1.15∶1。

圖3 物料摩爾比對產(chǎn)物收率及原料利用率的影響Fig.3 Effect of material mole ratio on product yield and isotope utilization

3.1.3反應(yīng)時間

固定碘甲烷與尼泊金乙酯的摩爾比為n(碘甲烷)∶n(尼泊金乙酯)=1.15∶1，反應(yīng)溫度為80 ℃，考察反應(yīng)時間對同位素原料(碘甲烷)利用率的影響，結(jié)果示于圖4。

圖4 反應(yīng)時間對同位素原料利用率的影響Fig.4 Effect of reaction time on the utilization of isotope material

由圖4可知，隨著反應(yīng)時間的延長，同位素原料利用率提高較快，當(dāng)反應(yīng)時間大于6 h時，同位素原料利用率有所下降，這可能是反應(yīng)時間過長致使副反應(yīng)發(fā)生。因此，合適的反應(yīng)時間為6 h。

3.2 穩(wěn)定同位素13C或D標(biāo)記

在單因素試驗(yàn)優(yōu)化的工藝條件下，用碘甲烷-13C(13CH3I)和碘甲烷-D3(CD3I)分別代替天然豐度碘甲烷，合成了對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C和對甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3產(chǎn)品。其中，對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C收率為91.12%，純度為99.1%，13C同位素豐度為99.0%，13C穩(wěn)定同位素原料利用率為79.32%，熔點(diǎn)為186.5～187.8 ℃；對甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3收率為90.49%，純度為99.0%，D同位素豐度為98.1%，D穩(wěn)定同位素原料利用率為78.70%，熔點(diǎn)為186.3～188.1 ℃。同位素豐度均未出現(xiàn)明顯稀釋，說明該工藝路線可行。

3.3 產(chǎn)品的表征

對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的LC-MS圖譜示于圖5。主峰ESI-MS-：m/z=152[M-H]-，比天然豐度對甲氧基苯甲酸多1個質(zhì)量數(shù)，計算13C同位素豐度為99.0%。

圖5 甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的質(zhì)譜圖Fig.5 MS of [13C] p-methoxybenzoic acid

圖6 甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3的質(zhì)譜圖Fig.6 MS of [D3] p-methoxybenzoic acid

對甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3的LC-MS圖譜示于圖6。主峰ESI-MS-：m/z=154[M-H]-，比天然豐度對甲氧基苯甲酸多3個質(zhì)量數(shù)，計算D同位素豐度為98.1%。

對甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的核磁共振(1H NMR)圖譜示于圖7。1H NMR(500 MHz,CDCl3)，δ：8.06(2H,d,ph-H),6.94(2H,d,ph-H),3.87(3H,m,Me-H)。

圖7 甲氧基苯甲酸-甲氧基-13C的1H NMRFig.7 1H NMR of [13C] p-methoxybenzoic acid

對甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3的1H NMR圖譜示于圖8。1H NMR(500 MHz,CDCl3)，δ：8.07(2H,d,ph-H),6.95(2H,d,ph-H)，與天然豐度對甲氧基苯甲酸1H NMR相比，無δ=3.87的位移，說明氘同位素取代位置與預(yù)期相同。

圖8 甲氧基苯甲酸-甲氧基-D3的1H NMRFig.8 1H NMR of [D3] p-methoxybenzoic acid

4 結(jié)論

(1) 本文以穩(wěn)定同位素13C或D標(biāo)記碘甲烷和尼泊金乙酯為原料，堿性條件下經(jīng)2步反應(yīng)制備得到穩(wěn)定同位素13C或D標(biāo)記對甲氧基苯甲酸，反應(yīng)條件溫和、對設(shè)備無特殊要求。

(2) 采用單因素試驗(yàn)對合成工藝關(guān)鍵步驟進(jìn)行優(yōu)化，得到了適合的反應(yīng)溫度、物料摩爾比、反應(yīng)時間等工藝條件，產(chǎn)品的收率大于91%，穩(wěn)定同位素原料(CD3I和13CH3I)利用率均大于78%，降低了產(chǎn)品的開發(fā)成本。

(3) 產(chǎn)品經(jīng)LC-MS進(jìn)行純度和同位素豐度分析，經(jīng)1H NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)，化學(xué)純度均大于99%，13C同位素豐度為99.0%，D同位素豐度為98.1%，同位素豐度未出現(xiàn)明顯稀釋。

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