徐仲杰，涂亞輝，鐘佳琪，孫 雯，汪忠華，王浩然，白少飛，吳范宏

(1.上海化工研究院有限公司 國(guó)家同位素工程技術(shù)研究中心 上海分中心，上海 200062；2.上?；ぱ芯吭河邢薰?上海穩(wěn)定性同位素工程技術(shù)研究中心，上海 200062；3.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)，上海 201418)

目前，各種癌癥嚴(yán)重威脅人類生命，研發(fā)高效的抗癌藥物已刻不容緩。早期的抗腫瘤藥物，對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞缺乏選擇性，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也殺死正常細(xì)胞。近年來(lái)，新發(fā)現(xiàn)的分子靶向藥物，能夠針對(duì)性地作用于腫瘤細(xì)胞，療效良好，不良反應(yīng)少，逐漸成為抗腫瘤藥物的發(fā)展方向。1997年，全球第一個(gè)靶向抗腫瘤藥物——利托普希單抗上市，藥物研究已進(jìn)入精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代，全球每年都有多個(gè)面向不同作用靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物進(jìn)入全球醫(yī)藥市場(chǎng)。

20世紀(jì)70年代，美國(guó)科研人員在非洲灌木矮柳樹(shù)的樹(shù)皮中分離出天然產(chǎn)物——考布他汀(Combretastatin A4, CA4)。并研制出分子靶向藥物，能夠很好的抑制微管蛋白聚合和分裂[1]。由于其良好的生物活性，英國(guó)、美國(guó)等已將其引入臨床評(píng)估，同時(shí)越來(lái)越重視對(duì)CA4結(jié)構(gòu)的修飾以及類似物的開(kāi)發(fā)，針對(duì)CA4結(jié)構(gòu)的修飾主要集中在3個(gè)部位：A環(huán)、B環(huán)和順式雙鍵，成為抗腫瘤新藥研究的熱點(diǎn)方向之一[2-12]。

汪忠華等[13-14]報(bào)道了一種以苯胺丙炔和疊氮衍生物反應(yīng)制備1,2,3-三氮唑衍生物的方法，具有一定的抗腫瘤活性。碳氘鍵比碳?xì)滏I更穩(wěn)定，有利于延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的代謝時(shí)間，提高藥效，而氟代藥物分子小，相容性高，本課題組利用氘標(biāo)記合成的優(yōu)勢(shì)，在前期分子活性結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，引入氘標(biāo)記的-OCD3基團(tuán)，形成氘代和氟代的協(xié)同作用，創(chuàng)制新型氘代氟代氨甲基三氮唑類抗腫瘤新藥。

1 主要儀器與試劑

IKA C-MAG HS7加熱磁力攪拌器：德國(guó)IKA公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海衛(wèi)凱儀器有限公司；BrukerSpectrospin 500 UltrashieldTM核磁共振儀：德國(guó)Bruker公司；Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜：美國(guó)Waters公司；TSQ Quantum Acess液質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)熱電公司。

碘甲烷-D3：豐度99.0%，上?；ぱ芯吭河邢薰?；5-氟-2-硝基苯酚：分析純(AR)，上海阿拉丁試劑有限公司；3-甲氧基苯胺、3-溴丙炔：AR，上海泰坦科技股份有限公司；濃鹽酸、亞硝酸鈉、甲醇、異丁醇、抗壞血酸、硫酸銅：均為AR，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

化合物的合成采用逆合成分析，結(jié)合有機(jī)合成原理，以穩(wěn)定、廉價(jià)、易得的碘甲烷-D3為原料，經(jīng)過(guò)甲基化、硝基還原、炔基取代、疊氮化以及環(huán)化反應(yīng)合成1-(3-甲氧基苯基)-[4-(4-氟-2-甲氧基-D3苯胺)甲基]-1,2,3-三氮唑。合成路線示于圖1。

2.1 5-氟-2-硝基苯甲醚-D3(2)的合成

圖1 化合物(8)的合成路線Fig.1 The synthetic route of compound (8)

在100 mL三口反應(yīng)瓶中加入化合物5-氟-2-硝基苯酚3.4 g、無(wú)水碳酸鉀5.0 g和無(wú)水丙酮40 mL，氮?dú)庵脫Q三次，冰浴攪拌10 min后，用注射器緩慢加入碘甲烷-D33.2 g，繼續(xù)冰浴反應(yīng)0.5 h，然后升溫回流6 h停止反應(yīng)，水洗，用乙酸乙酯萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，濃縮，得到黃色固體5-氟-2-硝基苯甲醚-D3(2)，收率90.0%(以碘甲烷-D3計(jì))。1H NMR(CDCl3，500 MHz)，δ 6.75(m,2H)，7.95(dd,J1=9.0 Hz,J2=6.0 Hz,1H)，鑒定為目標(biāo)產(chǎn)物。

2.2 4-氟-2-甲氧基苯胺-D3(3)的合成

在100 mL圓底燒瓶中加入自制的5-氟-2-硝基苯甲醚-D33.5 g，加入50 mL乙醇溶解，攪拌。稱取2.0 g的五水合硫酸銅溶于30 mL水中，加入至上述體系中，冰水浴下，分批向反應(yīng)體系中加入硼氫化鈉3.8 g，繼續(xù)在冰水浴條件下反應(yīng)3 h，用氯仿萃取三次，水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓去除溶劑得到棕色液體2.8 g，收率為90.5%(5-氟-2-硝基苯甲醚-D3計(jì))。ESI-MS：145.09(M+1)+，1H NMR(CDCl3，500 MHz)，δ 3.59(br,2H)，6.47～6.61(m,2H)，7.25(s,1H)，鑒定為目標(biāo)產(chǎn)物。

2.3 4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3(5)的合成

在100 mL三口燒瓶中加入無(wú)水碳酸鉀7.0 g和5-氟-2-硝基苯胺2.8 g，加入50 mL丙酮攪拌均勻，在常溫條件下滴加溴丙炔2.0 g，滴加結(jié)束后升溫至50 ℃反應(yīng)4 h，停止反應(yīng)。水洗后用氯仿萃取，無(wú)水硫酸鎂干燥，抽濾，減壓除溶得黑棕色粗品。柱層析提純后得到棕色液體2.9 g，收率85.7%(以4-氟-2-甲氧基苯胺-D3計(jì))。ESI-MS：182.1(M)+，1H NMR(CDCl3，500 MHz)，δ2.21(t,J=2.4 Hz,1H)，3.94(d,J=1.8 Hz,2H)，4.26(br,1H)，6.56～6.62(m,3H)，鑒定為目標(biāo)產(chǎn)物。

2.4 間甲氧基苯疊氮化鈉(7)的合成

將10 mL水和10 mL鹽酸先后加入100 mL三口燒瓶中，冰水浴冷卻后，加入3-甲氧基苯胺2.5 g，攪拌5 min，加入含亞硝酸鈉1.6 g的水溶液，稱取疊氮化鈉1.6 g溶于水中，緩慢地滴加到反應(yīng)體系中，加完后繼續(xù)攪拌1 h，薄層色譜檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)行直至原料反應(yīng)完全。萃取，洗滌，干燥，抽濾，負(fù)壓除溶劑后得到間甲氧基苯疊氮化鈉3.1 g，收率85.1%(以間甲氧基苯胺計(jì))。

2.5 1-(3-甲氧基苯基)-[4-(4-氟-2-甲氧基-D3苯胺)甲基]-1,2,3-三氮唑-D3(8)的合成

在100 mL三口燒瓶中依次加入間甲氧基苯疊氮化鈉1.2 g，4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D31.3 g，五水合硫酸銅0.15 g，抗壞血酸鈉1.2 g，異丁醇10 mL，水10 mL，室溫?cái)嚢? h，停止反應(yīng)。采用4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3后處理方法得到橘色固體粗品，柱層析得到橘色固體2.9 g，收率86.3%(以4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3計(jì))，總收率60.2%(以碘甲烷-D3計(jì))。純度99.0%，豐度99.0%。ESI-MS：332.11(M+1)+,1H NMR(CDCl3，500 MHz)，3.86(s,3H)，4.52(d,J=1.8 Hz,2H)，4.54(br,1H)，6.57～6.62(m,3H)，6.92(s,H)，7.22～7.40(m,3H)，7.87(s,H)。

3 結(jié)果與分析

綜上分析，在化合物1-(3-甲氧基苯基)-[4-(4-氟-2-甲氧基-D3苯胺)甲基]-1,2,3-三氮唑的(8)的五步反應(yīng)過(guò)程中，產(chǎn)物經(jīng)鑒定為目標(biāo)產(chǎn)物。第三步合成4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3的收率初期探索時(shí)僅約50%，副產(chǎn)物多且影響下一步反應(yīng)，其他幾步合成收率穩(wěn)定，基本都大于85%，故第三步反應(yīng)的收率對(duì)最終產(chǎn)品(8)的收率具有較大影響，對(duì)第三步反應(yīng)的溫度、時(shí)間、投料比等條件進(jìn)行優(yōu)化。

3.1 合成收率影響因素

3.1.1反應(yīng)溫度

反應(yīng)溫度對(duì)4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3的收率影響較大，實(shí)驗(yàn)中固定反應(yīng)時(shí)間4 h，n(4-氟-2-甲氧基苯胺)：n1(溴丙炔)=1∶1.2，研究溫度變化對(duì)收率的影響，結(jié)果示于圖2。從圖2結(jié)果可知，當(dāng)反應(yīng)體系的溫度低于0 ℃時(shí)反應(yīng)收率較低，其原因可能是溫度低，反應(yīng)活性低，反應(yīng)較難發(fā)生，收率低；當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，收率隨著溫度升高而降低，是因?yàn)闇囟雀呷菀装l(fā)生溴丙炔的二取代反應(yīng)，質(zhì)譜上顯示有二取代的分子離子峰，并且液相上明顯二取代雜峰增大，造成收率低，因此優(yōu)選反應(yīng)溫度為50 ℃。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3收率的影響Fig.2 Effect of temperature on synthesis of (4-Fluoro-2-methoxy-phenyl)-prop-2-ynyl-amine-D3

3.1.2反應(yīng)投料比

為了提高4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3的反應(yīng)收率，研究4-氟-2-甲氧基苯胺-D3和溴丙炔的物質(zhì)的量比對(duì)4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3反應(yīng)收率的影響，具體結(jié)果列于表1。由表1結(jié)果可知，當(dāng)反應(yīng)物質(zhì)的量比達(dá)到1∶1.2時(shí)，4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3的收率達(dá)到最大。

表1 反應(yīng)投料比對(duì)4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3收率的影響Table 1 Effect of ratio on the synthesis of (4-Fluoro-2-methoxy-phenyl)-prop-2-ynyl-amine-D3

注：反應(yīng)條件：反應(yīng)時(shí)間4 h，反應(yīng)溫度50 ℃；n∶n1=4-氟-2-甲氧基苯胺∶溴丙炔

3.1.3反應(yīng)時(shí)間

固定反應(yīng)物料比為1∶1.2，反應(yīng)溫度為50 ℃，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖3。由圖3結(jié)果可以看出,隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3收率迅速提高，到4 h后基本趨于穩(wěn)定,再延長(zhǎng)時(shí)間，收率略有下降，其原因是反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致溴丙炔二取代副產(chǎn)物的生成(質(zhì)譜上顯示有二取代的分子離子峰，并且液相上明顯二取代雜峰增大)，綜合成本考慮，選擇較優(yōu)的反應(yīng)時(shí)間為4 h。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)4-氟-2-甲氧基-1-丙炔基苯胺-D3合成收率的影響Fig.3 Effect of reaction time on synthesis of (4-Fluoro-2-methoxy-phenyl)-prop-2-ynyl-amine-D3

3.2 結(jié)構(gòu)表征

化合物(8)的1H NMR核磁譜圖分析示于圖4。1H NMR(CDCl3，500 MHz)，δ3.82(s,3H)，3.84(s,3H)，4.52(d,J=1.8 Hz,2H)，4.54(br,1H)，6.57～6.62(m,3H)，6.92(s,H)，7.22～7.40(m,3H)，7.87(s,H)。譜圖積分為17個(gè)氫，結(jié)構(gòu)上為17個(gè)氫，可見(jiàn)，合成產(chǎn)品的1H NMR與化合物(8)的結(jié)構(gòu)吻合，確定產(chǎn)品是目標(biāo)產(chǎn)物。

化合物(8)的LC-MS圖譜示于圖5，主峰m/z=332.11，為[M+H]峰，其質(zhì)量數(shù)332.11≈331.10+1(331為化合物(8)相對(duì)分子質(zhì)量)，結(jié)合核磁譜圖可以確認(rèn)為目標(biāo)化合物(8)，同位素豐度為99.0%。

圖4 化合物(8)的1H NMR譜圖Fig.4 1H NMR of compound (8)

3.3 活性測(cè)試

采用7sea-cell Counting Kit-8(CCK-8)染色法檢測(cè)化合物(8)的細(xì)胞活力。取活細(xì)胞比例達(dá)90%以上的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)采用CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒。細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)、制成濃度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，96孔板中每孔加入100 μL細(xì)胞懸液(每孔1×104個(gè)細(xì)胞)；96孔板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；每孔加入100 μL含藥物的培養(yǎng)基，設(shè)立陰性對(duì)照組，溶媒對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，每組5復(fù)孔；96孔板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后；每孔加入10 μL CCK-8溶液,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的OD值，計(jì)算化合物(8)對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、人肝癌細(xì)胞HepG2、人胃癌細(xì)胞MGC-803、人胃癌細(xì)胞MKN45等細(xì)胞的抑制率及IC50值。劑量設(shè)置：劑量1組：100 μmol/L；劑量2組：50 μmol/L；劑量3組：25 μmol/L；劑量4組：12.5 μmol/L；劑量5組：6.25 μmol/L；劑量6組：3.125 μmol/L；劑量7組：1.562 5 μmol/L；劑量8組：0.781 25 μmol/L；劑量9組：0.390 625 μmol/L；劑量10組：0.195 312 5 μmol/L；陽(yáng)性對(duì)照：10 μg/mL。

圖5 化合物(8)的LC-MS譜圖Fig.5 The LC-MS ofcompound (8)

化合物(8)對(duì)腫瘤細(xì)胞的IC50值列于表2，表2結(jié)果表明，化合物(8)對(duì)A549、MGC803、MKN45、HepG2等表現(xiàn)出廣譜的抗腫瘤活性，具有成為抗腫瘤藥物的潛力。

表2 化合物(8)對(duì)腫瘤細(xì)胞的IC50值Table 2 The IC50 values of compound (8) to tumour cell

4 結(jié)論

本研究采用碘甲烷-D3為原料，經(jīng)過(guò)甲基化、硝基還原、炔基取代、疊氮化以及環(huán)化反應(yīng)合成1-(3-甲氧基苯基)-[4-(4-氟-2-甲氧基-D3苯胺)甲基]-1,2,3-三氮唑。該合成方法簡(jiǎn)單而且穩(wěn)定性高，以碘甲烷-D3計(jì)，目標(biāo)產(chǎn)物總收率為60.2%，化學(xué)純度為99.0%，同位素豐度為99.0%?；衔锞哂袕V譜抗腫瘤活性，有望成為抗腫瘤藥物。

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