詹 爽，趙小英，汪琛瑋，吳興旺

隨著分子生物學技術和臨床治療水平的快速發(fā)展，非小細胞肺癌的臨床治療手段特別是新型的分子靶向藥物治療有了明顯的進步。吉非替尼是目前臨床廣泛應用的一種分子靶向藥物，與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物相比有選擇性好、不良反應小、療效高等特點[1]。但臨床在治療前需穿刺活檢行基因檢測，以判斷是否適合使用該藥。但由于操作等技術限制，使得穿刺活檢有一定的假陰性結(jié)果。治療前無創(chuàng)的評估藥物的療效，一直是臨床追求的目標。該研究合成了一種以吉非替尼主要功能基團為母核的新型含碘靶向抗腫瘤藥物，并進行細胞實驗及能譜CT掃描觀察其抗腫瘤活性及CT能譜顯像能力。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器化合物7-甲氧基-(3-嗎啉-4-丙氧基)喹唑啉-4(3H)-酮、化合物3-氯-4-碘苯胺(上海薩恩化學技術有限公司)；人非小細胞肺癌細胞A549(安徽醫(yī)科大學藥學院)；吉非替尼(gefitinib，英國Astra Zeneca 公司)；胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)液和胎牛血清(美國 Gibco公司)；二甲基亞砜(DMSO)和β-actin抗體(美國Sigma公司)； GE Discovery CT750 HD掃描儀及AW4.5后處理工作站(美國GE公司)。

1.2實驗方法

1.2.1靶向藥物制備 化合物N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉-4-丙氧基)喹唑啉-4-胺)與化合物7-甲氧基-(3-嗎啉-4-丙氧基)喹唑啉-4(3H)-酮與化合物3-氯-4-碘苯胺進行化學反應，獲得與吉非替尼相似靶向藥物(N-(3-氯-4-氟碘苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉-4-丙氧基)喹唑啉-4-胺)(圖1)，用于細胞實驗及能譜CT掃描。

圖1 靶向藥物制備化學方程式

項目藥物濃度(mmol/L)01.8753.757.51530靶向藥物CT值(HU)-32±1.5-19±0.6-15±1.0-11±1.03±0.766±3.1吉非替尼CT(HU)-32±2.5-35±1.6-36±1.3-35±0.6-32±3.6-28±1.5靶向藥物碘濃度值(mg/ml)0.07±0.11.03±0.11.37±0.21.97±0.36.67±0.341.1±0.8吉非替尼碘濃度值(mg/ml)0.03±0.10.26±0.10.77±0.10.67±0.10.96±0.11.07±0.1

1.2.2MTT法測靶向藥物和吉非替尼對細胞增殖的影響 A549細胞單層接種在含體積分數(shù)為10%的胎牛血清和DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d傳代一次。

取對數(shù)生長期的A549細胞，以5×103個每孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，待細胞完全貼壁后，分別加入不同濃度的靶向藥物(2.5、5、10、20、40 μmol/L)，陰性對照組加入體積分數(shù)為0.1%的DMSO。48 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液，每孔加入150 μl DMSO，37 ℃震蕩15 min后用酶標儀在570 nm波長處檢測其吸光度(OD)值。按公式計算細胞增殖抑制率：抑制率(inhibition rate,IR)(%)=(1-實驗組吸光值/對照組吸光值)×100%，實驗重復3次。測量吉非替尼對A549細胞增殖抑制率同靶向藥物實驗方法及條件。

1.3統(tǒng)計學處理應用SPSS 15.0軟件進行分析，兩兩比較采用配對t檢驗，分別統(tǒng)計兩種藥物對A549細胞增殖抑制及靶向藥物與吉非替尼CT值及碘濃度值，靶向藥物碘濃度值與真實值之間的相關性采用線性回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1靶向藥物和吉非替尼對A549細胞增殖的影響MTT法結(jié)果顯示，靶向藥物及吉非替尼均能明顯抑制A549細胞的增殖，且呈時間劑量依賴性，以40 μmol/L靶向藥物濃度對A549細胞作用48 h的抑制率最高，濃度超過10 μmol/L時，靶向藥物抑制率高于吉非替尼，二者之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 靶向藥物與吉非替尼對A549的增殖抑制

2.2靶向藥物與吉非替尼CT值、碘濃度值測量及靶向藥物碘濃度與真實值相關性能譜CT AW4.5后處理工作站測量結(jié)果如圖所示，隨藥物濃度增加，靶向藥物溶液CT值及碘濃度值明顯高于吉非替尼溶液(表1)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。二者碘基物質(zhì)圖像(圖3)可以看出，靶向藥物具有更高密度顯示，隨濃度下降，二者對比減弱。

圖3 靶向藥物(上排)與吉非替尼(下排)溶液碘基物質(zhì)圖

靶向藥物分子量為574.8，碘的原子量為127，據(jù)此換算出1 mmol/L藥物含碘濃度為1.733 mg/ml。不同濃度靶向藥物所測得碘濃度值與真實值的測定結(jié)果見表2。碘濃度的測量值與真實值之間成線性正相關性(r=0.998)，且碘二者數(shù)值之間比較差異無統(tǒng)計學意義(t=6.18，P>0.05)。

表2 碘基物質(zhì)圖測量靶向藥物碘測量值與真實值(mg/ml)

3 討論

肺癌作為發(fā)病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤之一，目前病死率在我國城市已居腫瘤死亡首位，非小細胞肺占肺癌總發(fā)生率的85%左右，其預后差、致死率高，且大多數(shù)患者就診時已屬晚期，失去手術切除機會，因此，化療方式必不可少[2]。目前，臨床上靶向治療相關的基因成為研究重點，特異性較高的分子靶點有效延長肺癌患者生存時間，提高患者生活質(zhì)量，降低對正常組織細胞的毒副作用。研究[3-4]顯示，吉非替尼是一種選擇性表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor- tyrosine kinase inhibitors， EGFR-TKIs)，屬于苯胺喹唑啉類，可與ATP競爭性地和EGFR的酪氨酸激酶胞內(nèi)區(qū)位點結(jié)合，從而明顯抑制EGFR跨膜細胞表面受體上酪氨酸激酶的自身磷酸化，阻止細胞增殖，促進凋亡 ，目前廣泛應用于臨床治療非小細胞肺癌的患者。本研究制備了新型靶向藥物(N-(3-氯-4-氟碘苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉-4-丙氧基)喹唑啉-4-胺)，該化合物不僅具有與吉非替尼相似的化學結(jié)構(gòu)，同時化合物內(nèi)含有碘元素，使其既具有靶向功能，又具有CT對比劑的作用，從而達到靶向診斷及治療的目的。

3.1靶向藥物對A549的增殖抑制作用為了明確靶向藥物的抗腫瘤活性，本研究以吉非替尼為對照組，使用相同濃度對A549行細胞培養(yǎng)，并進行細胞實驗研究。MTT實驗結(jié)果表明，隨著靶向藥物濃度增加，IR呈增高趨勢，提示靶向藥物可明顯抑制A549細胞生長，當作用時間達到48 h時，靶向藥物具有最高的抑制率。當藥物濃度超過10 μmol/L時，靶向藥物抑制率超過吉非替尼，且二者之間差異具有統(tǒng)計學意義，這一結(jié)果提示本研究藥物抗腫瘤藥物效果可能高于吉非替尼，有待今后進一步深入實驗研究確認。

3.2能譜CT測量CT值及碘濃度值常規(guī)CT靠單一參數(shù)CT值成像，即密度成像。CT值代表X線穿過組織被吸收后的衰減值，CT值高低反映物質(zhì)的密度大小，根據(jù)物質(zhì)密度不同即CT值大小判斷組織性質(zhì)。隨著影像技術的發(fā)展和設備的不斷更新，寶石CT能譜成像改變了這一傳統(tǒng)診斷模式，不再單純利用CT值進行診斷。能譜CT是通過高低兩種能量快速切換，即80 kVp和140 kVp兩組電壓瞬時切換，得到兩組含有原始能量信息(即40～80 keV和40～140 keV)的原始數(shù)據(jù)。由于數(shù)據(jù)是在0.5 ms內(nèi)獲得，具有高度一致性，因此能夠在原始數(shù)據(jù)上進行重建。通過后處理技術，可以獲得更多的圖像信息及物質(zhì)信息，包括去除硬化偽影、優(yōu)化圖像質(zhì)量和對比噪聲比、物質(zhì)定量分析等[5-7]。本研究主要研究能譜CT的物質(zhì)定量分析功能，方法是通過后處理物質(zhì)分離技術獲得基物質(zhì)圖像，對基物質(zhì)進行測量得到物質(zhì)定量，可為臨床診斷提供準確客觀的依據(jù)[8]。一般基物質(zhì)對常由X線衰減值不同的2種物質(zhì)組成，醫(yī)學常用的基物質(zhì)對是碘和水。Wang et al[9]研究發(fā)現(xiàn)，GSI掃描含不同濃度碘溶液，后處理使用物質(zhì)分離技術測量試管內(nèi)碘濃度，發(fā)現(xiàn)能譜CT可對碘濃度進行定量測定。因此本研究也以碘水作為基物質(zhì)對，對靶向藥物溶液的碘含量進行定量分析。

CT值測量結(jié)果表明，隨著藥物濃度增加，CT值升高，這是因為藥物中含有可吸收較多X線的碘離子，因此當藥物濃度增加時，相應碘濃度上升，CT值即增加，具有較好的CT顯影能力，增加圖像對比。吉非替尼溶液里不含有吸收較多X線的物質(zhì)，因此藥物濃度的改變不影響藥物的CT值。

碘基物質(zhì)圖像測量結(jié)果表明，隨藥物濃度增加，所測得的碘濃度值同樣明顯升高，靶向藥物碘濃度測量值與真實值之間也存在明顯的線性正相關(r值為0.998)，說明測量碘濃度值可準確反映真實溶液的變化趨勢；而碘濃度的測量值與真實值相比，配對t檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者之間無統(tǒng)計學差異，說明能譜CT可準確測定物質(zhì)碘含量，這與王樂 等[10]、林婷婷 等[11]人的研究結(jié)果一致。

本研究對于靶向藥物對A549細胞增殖抑制進行了體外實驗研究，并對藥物行CT GSI能譜掃描，結(jié)果表明靶向藥物具有較好的抗腫瘤活性，且藥物內(nèi)含有可提高藥物CT值的碘離子，利于增加圖像對比，而后處理基物質(zhì)圖像準確測量碘濃度，從而明確了其判斷藥物濃度的能力，為日后進行活體動物實驗提供了理論支持。

本研究不足之處在于，未對靶向藥物行細胞周期及凋亡、蛋白定量測定等實驗，未深入探討其抗腫瘤細胞機制，仍有待進一步的實驗研究。

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