黃云龍，張仁泉，方炎鑫，姚 龍，吳開明

食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是東亞發(fā)展中國家較為常見的惡性腫瘤[1]，盡管各種治療策略已經(jīng)明顯改善并提高患者的預(yù)后及生存率，但ESCC仍然是最具侵襲性和預(yù)后較差的惡性腫瘤之一，其5年總生存率低于15%。以鉑類為基礎(chǔ)的化療仍是食管癌患者姑息性治療的常見治療方案，而部分患者對鉑類藥物的敏感性較差。因此，迫切需要一種新的治療靶點，可以應(yīng)用于判定抗癌藥物敏感性高的細(xì)胞或機(jī)體，也可以用于提高存在藥物抵抗性個體對藥物的敏感性。微小RNAs(micro ribonucleic acids，miRNAs or miRs)是一類內(nèi)生的、長度約為20～24個核苷酸的單非編碼小分子RNA，可通過調(diào)節(jié)基因的表達(dá)影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。最近，越來越多的研究[2]表明miRNAs藥物抵抗中發(fā)揮重要作用，已有研究[3-5]證實在有鉑類藥物抵抗的細(xì)胞中miR-218呈低表達(dá)，而恢復(fù)miR-218的表達(dá)可以增加鉑類化療藥的敏感性。因此揭示miR-218在鉑類耐藥的食管鱗癌細(xì)胞中的生物學(xué)特性和miR-218異常表達(dá)在調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞對鉑類耐藥的分子機(jī)制顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1材料與試劑食管鱗癌細(xì)胞Eca109購自上海生物科學(xué)院細(xì)胞庫；順鉑購自美國Sigma公司；RPMI-1640及胎牛血清購自美國Gibco公司；CCK8 試劑盒購自上海碧云天公司；AnnexinV-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；RNA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司；實時熒光定量試劑盒購自南京Vazyme公司；相關(guān)蛋白抗體購自英國Abcam公司。本實驗中涉及的基因及引物序列見表1。

表1 基因和引物序列

1.2方法

1.2.1細(xì)胞系及培養(yǎng) 食管鱗癌細(xì)胞Eca109采用含10%胎牛血清，1%青鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基，耐藥細(xì)胞Eca109/CisR用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基， 在37 ℃恒溫，含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)期狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實驗。

1.2.2耐藥株構(gòu)建 采用遞增藥物濃度、間歇沖擊作用的方法構(gòu)建耐藥細(xì)胞株[6]。取狀態(tài)良好并處于對數(shù)生長期的Eca109 細(xì)胞，從濃度為0.5 μmol/L 的 Cisplatin 開始培養(yǎng)，24 h后更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，觀察到細(xì)胞恢復(fù)正常生長，再次用初始濃度的 Cisplatin 培養(yǎng)基培養(yǎng) Eca109 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞死亡后換為新鮮的完全培養(yǎng)基，細(xì)胞穩(wěn)定生長并傳代3次，測定半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。隨后提高 Eca109濃度反復(fù)作用直至細(xì)胞能在10 μmol/L Cisplatin 的培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)并連續(xù)傳代3次，最后測 Eca109 的 Cisplatin 耐藥細(xì)胞株 IC50為(18.68±0.94) μmol/L，命名為 ECA109/CisR。

1.2.3RNA提取 定量即時聚合酶鏈鎖反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction ，qRT-PCR) 采用TRIzol方法提取細(xì)胞總RNA,并使用微量分光光度計測濃度及純度(一般要求OD260/OD280為1.8～2.2之間)。按照Vazyme實時熒光定量試劑盒說明書具體步驟，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增，同時以U6作為內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增，miR-218的表達(dá)量為其與該樣本中內(nèi)參U6的相對表達(dá)量，由公式Folds=2-ΔΔCt檢測ECA109/ECA109-CisR、miRNA-218 mimics/ Negative Control miR-218的差異性表達(dá)。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗，6孔板細(xì)胞數(shù)：3×105/孔；96孔板細(xì)胞數(shù)3×103個/孔分別均為種于每孔，培養(yǎng)12 h至細(xì)胞密度達(dá)80%，應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑siRNA-Mate(上海吉瑪公司)進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染法并參照產(chǎn)品說明書，將miRNA-218 mimics、Negative Control(NC)(終濃度50 nmol/L)與 Si-Mate按比例加入每孔。轉(zhuǎn)染miRNA-218 mimics作為實驗組，Negative Control(NC)作為對照組。

1.2.5CCK8法檢測細(xì)胞增殖 將實驗分為兩組：miRNA-218 mimics轉(zhuǎn)染組，NC對照組。每組在轉(zhuǎn)染后不同時間點0、24、48、72 h分別取3個重復(fù)孔進(jìn)行實驗。棄原培養(yǎng)基后加入含有10% CCK-8的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm波長處的吸光度(optical density，OD)值。同樣的方法作瞬時轉(zhuǎn)染，24 h后，給予兩組細(xì)胞不同終濃度順鉑處理，每個濃度梯度分別設(shè)置3個重復(fù)孔，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，同樣方法檢測各孔450 nm波長的OD值。以上每組實驗操作重復(fù)3次，并取重復(fù)孔平均值。細(xì)胞抑制率=(0 h藥物濃度OD值-任意h藥物濃度OD值)/(0 h藥物濃度OD值)×100%，IC50值是指導(dǎo)致細(xì)胞抑制率為50%時的藥物濃度。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 取6孔板作Eca109/CisR細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染，miRNA-218 mimics為轉(zhuǎn)染組，NC為對照組，48 h后，參照AnnexinV-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，收集細(xì)胞(注意保留培養(yǎng)基)，500 r/min低速離心5 min后，用預(yù)制冷的1×PBS洗滌兩遍，加入300 μl 的1×Binding Buffer 制成細(xì)胞懸液；加入5 μl的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min，上機(jī)前5 min再加入5 μl的PI染色并補(bǔ)加200 μl的1×Binding Buffer混勻，上機(jī)檢測凋亡比率。同樣的方法做細(xì)胞轉(zhuǎn)染，48 h后，兩組加入含有終濃度5 μmol/L順鉑的完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱48 h，上機(jī)檢測凋亡比率。

1.2.7Western blot檢測細(xì)胞中蛋白的表達(dá) 收集經(jīng)不同方法處理的Eca109/CisR細(xì)胞，分為四組：NC組，miRNA-218 mimic組，NC+ Cisplatin組， miRNA-218 mimics+ Cisplatin組。用RIPA/PMSF(100 ∶1)冰上裂解30 min，14 000 r/min 離心15 min，收集上清液用 BCA法測定總蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度計算上樣體積，30 μg蛋白樣品在10% SDS-PAGE 凝膠中電泳分離、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST 10 min/次搖床洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST 10 min/次搖床洗膜3 次后顯色。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用 SPSS 18.0 軟件進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗分析。以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Eca109/CisR耐藥株及耐藥測定CCK8法檢測結(jié)果證實，Eca109、Eca109/CisR細(xì)胞在不同Cisplatin濃度處理后，與食管鱗癌細(xì)胞Eca109比較，Eca109/CisR細(xì)胞增殖受明顯抑制；根據(jù)公式測算兩組細(xì)胞IC50值分別為(4.9±1.04) μmol/L和(18.88±0.94) μmol/L，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

2.2miRNA-218在細(xì)胞株Eca109和Eca109/CisR細(xì)胞中表達(dá)實時熒光定量PCR法檢測結(jié)果顯示：與Eca109細(xì)胞比較，Eca109/CisR細(xì)胞中miRNA-218表達(dá)下調(diào)；與NC組比較，miR-218 mimics組Eca109/CisR細(xì)胞中miRNA-218表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

2.3CCK8檢測不同方式處理后耐藥細(xì)胞Eca109/CisR增殖活性轉(zhuǎn)染miRNA-218 mimics，CCK8法檢測兩組不同時段(0、24、48和72 h)Eca109/CisR細(xì)胞增殖能力，miRNA-218抑制Eca109/CisR細(xì)胞增殖能力；轉(zhuǎn)染miRNA-218 mimics 24 h后， 用不同終濃度的Cisplatin(0、2.5、5、10、20和40 μmol/L)處理，與NC組相比，miRNA-218 mimics組Eca109/CisR 的OD值明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖1 CCK8法檢測Cisplatin對Eca109和Eca109/CisR細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)

A：CCK8測兩組細(xì)胞增殖能力；B：兩組細(xì)胞IC50值；與食管鱗癌細(xì)胞Eca109/CisR比較：*P<0.05，**P<0.01；與食管鱗癌細(xì)胞Eca109比較：##P<0.01

圖2 實時熒光定量PCR檢測miRNA-218的表達(dá)量

A：Eca109細(xì)胞與Eca109/CisR細(xì)胞中miRNA-218的表達(dá)；B：NC組與miR-218 mimics組Eca109/CisR細(xì)胞中miRNA-218表達(dá)；與 Eca109細(xì)胞比較：**P<0.01；與NC組比較：##P<0.01

2.4流式細(xì)胞術(shù)法檢測過表達(dá)miRNA-218對Eca109/CisR細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明， 轉(zhuǎn)染miRNA-218 mimics組和NC組Eca109/CisR 細(xì)胞凋亡率分別為5.33%和2.05%；轉(zhuǎn)染miRNA-218 mimics組和NC組Eca109/CisR 細(xì)胞后給予濃度5 μmol/L的Cisplatin處理 ，細(xì)胞凋亡率分別為28.8%和7.42%(圖4)。

2.5轉(zhuǎn)染miRNA-218mimics和Cisplatin處理后Eca109/CisR細(xì)胞中抗凋亡蛋白Survivin、Mcl-1和Bcl-2的表達(dá)Western blot 法結(jié)果顯示，與NC組細(xì)胞比較，miR-218 mimics 組和miRNA-218 mimics+Cisplatin組Eca109/CisR細(xì)胞中抗凋亡蛋白Survivin、Mcl-1和Bcl-2表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

圖3 miRNA-218 mimics 和Cisplatin對Eca109/CisR細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)

A：miR-218 mimics抑制Eca109/CisR細(xì)胞增殖；B：miR-218 mimics增加Eca109/CisR細(xì)胞對Cisplatin的敏感性；與NC組比較：**P<0.01；與NC+Cisplatin組比較：#P<0.05

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測對Eca109/CisR細(xì)胞凋亡率的影響

A:NC組；B：miRNA-218 mimics組；C：NC+Cisplatin組；D：miRNA-218 mimics+Cisplatin組

圖5 抗凋亡蛋白Survivin、Mcl-1和Bcl-2表達(dá)量的變化

A:NC組；B：miRNA-218 mimics組；C：NC+Cisplatin組；D：miRNA-218 mimics+Cisplatin組

3 討論

以藥物順鉑為基礎(chǔ)的化療藥物耐藥性仍然是食管鱗狀細(xì)胞癌治療的主要難題，大量的microRNAs被證實參與食管鱗癌細(xì)胞順鉑耐藥性調(diào)控機(jī)制[7]，而miR-218也被證實在多種癌癥的耐藥性的形成起到重要作用[8]，甚至部分學(xué)者認(rèn)為通過檢測miRNA的表達(dá)，預(yù)測腫瘤患者對藥物治療的敏感性[9]。miR-218增加口腔癌對順鉑的耐藥性[7]，異于本研究中證實的miR-218與順鉑耐藥性之間的關(guān)系，本研究證實miR-218在順鉑耐藥的食管鱗癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，而過表達(dá)miR-218可以促進(jìn)耐藥細(xì)胞藥物敏感性，進(jìn)而可以認(rèn)為miR-218調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。

Survivin基因是一個細(xì)胞凋亡抑制基因，具有強(qiáng)大的凋亡抑制功能，同時也參與部分腫瘤耐藥性的調(diào)節(jié)[10]。而在乳腺癌細(xì)胞中[11]，miR-218抑制survivin基因表達(dá)以調(diào)節(jié)起對化療的耐藥性，與此同時，學(xué)者Lin et al[12]也提出相似觀點，miR-218通過作用于survivin基因的表達(dá)促進(jìn)食管癌細(xì)胞對順鉑藥物的敏感性?？沟蛲龌駼cl2家族參與調(diào)控基因介導(dǎo)的細(xì)胞的多要耐藥性MDR，諸如上調(diào) miR-15b 和表達(dá)可以增加 SGC7901/VCR 細(xì)胞由長春新堿誘導(dǎo)凋亡的敏感性,這種改變就是通過作用于靶基因Bcl-2 來實現(xiàn)的[13]。本研究中miR-218介導(dǎo)的Bcl2蛋白實現(xiàn)食管癌耐藥性降低的原因，可能是基于miR-218抑制Wnt/β-catenin信號通路[14]，抑制Bcl-2的表達(dá)。同時Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因中包括有細(xì)胞周期相關(guān)基因Cyclin, 原癌基因C-myc、Survivin、Mcl-1,血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)基因等，Survivin、Mcl-1是凋亡抑制因子，二者表達(dá)水平下降，會啟動主要依賴于Caspase 途徑的凋亡程序, 導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜電位下降和Caspase-3的活化。同樣miR-218也可以抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路[4]，而PI3K/AKT/mTOR信號通路可以通過抑制Bcl-2的表達(dá)[15]，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而間接增加食管癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。Mcl-1是 Bcl-2家族的一個重要成員，在凋亡的調(diào)控中起著重要作用。已有研究[5]證實，在肺癌細(xì)胞中，miR-205/miR-218促進(jìn)對卡鉑耐藥的肺癌細(xì)胞的凋亡，通過抑制Mcl-1的表達(dá)得以實現(xiàn)。因此，在本研究中，通過過表達(dá)miR-218實現(xiàn)食管癌對順鉑敏感性的增加，其中具體分子機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)抗凋亡基因survuvin、mcl-1、bcl-2表達(dá)，促進(jìn)耐藥細(xì)胞的凋亡，而是否存在分子信號通路如Wnt/β-catenin、PI3K/AKT/mTOR的參與來影響藥物敏感性，有待進(jìn)一步研究證實。

本研究證實，miRNA-218在食管鱗狀細(xì)胞癌對順鉑藥物的敏感性和耐藥性方面具有潛在的調(diào)控作用, 而這些調(diào)控機(jī)制可能涉及直接或間接作用于凋亡基因的表達(dá)。鑒于未做臨床病例血清學(xué)和(或)者組織學(xué)miRNA-218表達(dá)的差異性對比，miRNA-218是否可以作為有用的生物標(biāo)記物,用來預(yù)測患者對化療的敏感度及生存預(yù)后，尚待進(jìn)一步研究佐證?？偟膩碚f,上調(diào)miRNA-218表達(dá)可以提高耐藥的食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對順鉑藥物的敏感性，miRNA-218可作為設(shè)計靶向藥的分子靶點，應(yīng)用于對順鉑耐藥的食管鱗狀細(xì)胞癌患者的臨床靶向治療。

[1] Ferlay J, Shin H R, Bray F, et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008[J]. Int J Cancer,2010,127(12):2893-917.

[2] Donzelli S, Mori F, Biagioni F, et al. MicroRNAs: short non-coding players in cancer chemoresistance[J]. Mol Cell Ther, 2014,2(1):1-12.

[3] Xie J, Yu F, Li D, et al. MicroRNA-218 regulates cisplatin (DPP) chemosensitivity in non-small cell lung cancer by targeting RUNX2[J]. Tumour Biol, 2016,37(1):1197-204.

[4] Tian H, Hou L, Xiong Y M, et al. miR-218 suppresses tumor growth and enhances the chemosensitivity of esophageal squamous cell carcinoma to cisplatin[J]. Oncol Rep, 2015, 33(2):981-9.

[5] Zarogoulidis P, Petanidis S, Kioseoglou E, et al. MiR-205 and miR-218 expression is associated with carboplatin chemoresistance and regulation of apoptosisviaMcl-1 and Survivin in lung cancer cells[J]. Cell Signal, 2015, 27(8):1576-88.

[6] 李 敏, 王志舉, 李文濤,等. 人食管癌順鉑耐藥細(xì)胞系Ec9706/cDDP的建立及其生物學(xué)特征[J]. 世界華人消化雜志, 2006, 14(34):3257-60.

[7] Sugimura K, Miyata H, Tanaka K, et al. Let-7 expression is a significant determinant of response to chemotherapy through the regulation of IL-6/STAT3 pathway in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(18):5144-53.

[8] Zhuang Z, Hu F, Hu J, et al. MicroRNA-218 promotes cisplatin resistance in oral cancerviathe PPP2R5A/Wnt signaling pathway[J]. Oncol Rep, 2017, 38(4):2051.

[9] Yang N, Kaur S, Volinia S, et al. MicroRNA microarray identifies Let-7i as a novel biomarker and therapeutic target in human epithelial ovarian cancer[J]. Cancer Res, 2008, 68(24):10307-14.

[10] Wang S, Wang A, Shao M, et al. Schisandrin B reverses doxorubicin resistance through inhibiting P-glycoprotein and promoting proteasome-mediated degradation of survivin[J]. Sci Rep，2017，7(1):8419.

[11] Hu Y, Xu K, Yagüe E. miR-218 targets survivin and regulates resistance to chemotherapeutics in breast cancer[J]. Breast Cancer Res Treat, 2015, 151(2):269-80.

[12] Lin J, Wang W, Xu Q, et al. MiR-218 increases sensitivity to cisplatin in esophageal cancer cellsviatargeting survivin expression[J]. Open Med, 2016, 11(1):31-5.

[13] Zheng T, Wang J, Chen X, et al. Role of microRNA in anticancer drug resistance[J]. Int J Cancer, 2010, 126(1):2-10.

[14] Huang Y, Liang S H, Xiang L B, et al. miR-218 Promoted the Apoptosis of Human Ovarian Carcinoma CellsviaSuppression of the WNT/β-Catenin Signaling Pathway [J]. Mol Biol, 2017, 51(4):629-36.

[15] Huang C, Sheng S, Li R, et al. Lactate promotes resistance to glucose starvationviaupregulation of Bcl-2 mediated by mTOR activation[J]. Oncol Rep, 2015, 33(2):875-84.