郭晶晶,李 娜,霍琴琴,鐘 興,潘天榮

長(zhǎng)期高脂血癥是動(dòng)脈硬化發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素，脂質(zhì)沉積破壞內(nèi)膜的平滑性和完整性，促進(jìn)血漿中自由基產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)發(fā)生、平滑肌細(xì)胞增生及遷移，而血管內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈硬化的始動(dòng)因素，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、減輕內(nèi)皮損傷是防治動(dòng)脈硬化的重要環(huán)節(jié)。目前動(dòng)脈硬化的防治措施，一方面是飲食及生活方式干預(yù)；另一方面是藥物治療，包括擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)血脂、抗血小板聚集、抗凝等。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一種由腸道L細(xì)胞合成和分泌的內(nèi)源性腸促胰島素激素，呈葡萄糖依賴性的促進(jìn)胰島素的分泌，同時(shí)具有改善血管內(nèi)皮功能，保護(hù)心血管系統(tǒng)的效應(yīng)[1]。利拉魯肽(Liraglutide)是一種GLP-1類似物，與天然GLP-1有97%的同源性，具有GLP-1的生理功能。該研究建立高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈硬化大鼠模型，通過比較血清學(xué)指標(biāo)、血管病理及血管張力的變化，評(píng)價(jià)利拉魯肽對(duì)動(dòng)脈硬化大鼠模型的治療效果。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及干預(yù)藥物清潔級(jí)雄性SD大鼠32只，約(170±10)g，購(gòu)自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為高脂組22只、對(duì)照組10只。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物、試劑及儀器利拉魯肽(諾和力)購(gòu)自丹麥諾和諾德公司(批號(hào)：FP51752-2)；胰島素ELISA試劑盒購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；大鼠內(nèi)皮素1(endothelin 1,ET-1)ELISA試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；ADVIA2400全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自德國(guó)西門子公司；熒光正置顯微鏡(尼康80i)購(gòu)自南京飛達(dá)光學(xué)儀器公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)脈硬化大鼠模型的建立及干預(yù) 高脂組大鼠予高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料配方為81.8%基礎(chǔ)飼料+6%豬油+2%膽固醇+10%蛋黃粉+0.2%膽鹽，購(gòu)自江蘇省協(xié)調(diào)生物工程有限責(zé)任公司，對(duì)照組給予普通飼料持續(xù)喂養(yǎng)，飲水均無限制。12周后從對(duì)照組和高脂組分別隨機(jī)抽取兩只老鼠處死，取主動(dòng)脈血管，做病理切片染色觀察，結(jié)果提示動(dòng)脈硬化大鼠模型造模成功。將高脂組隨機(jī)分為利拉魯肽組9只，安慰劑組9只，繼續(xù)予高脂飲食，且分別于皮下注射利拉魯肽0.6 mg/(kg·d)和生理鹽水0.6 mg/(kg·d)干預(yù)16周，正常對(duì)照組繼續(xù)予普通飼料喂養(yǎng)，期間自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)鼠籠飼養(yǎng)，每籠5只，溫度20～25 ℃，動(dòng)物室內(nèi)明暗各12 h左右。

1.3.2標(biāo)本采集及檢測(cè)方法 稱量大鼠體重，10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，充分暴露腹腔，腹主動(dòng)脈取血，離心后取上清液負(fù)80 ℃保存待測(cè)，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清三酰甘油(triglycerides,TG)、總膽固醇(cholesterol,CHO)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)含量；ELISA試劑盒檢測(cè)空腹胰島素 (fasting insulin,FINS)及ET-1水平；硝酸還原法測(cè)定血清一氧化氮(nitric oxide,NO)濃度。

1.3.3肝組織病理切片、HE染色及Masson染色 取0.5～1.0 cm腹主動(dòng)脈按照固定、脫水、石蠟包埋、切片、染色、烘干、封片的順序完成血管病理切片的制作，光鏡下觀察。

1.3.4血管張力測(cè)定 處死大鼠后迅速取出大鼠腸系膜上動(dòng)脈，置于Kerbs液中，并持續(xù)通入混合氣體(95% O2和5% CO2)，在解剖顯微鏡下操作，小心去除血管周圍的脂肪組織和結(jié)締組織，沿血管縱軸剪成長(zhǎng)約2 mm的血管環(huán)并固定，欲槽內(nèi)預(yù)置5 ml的Kerbs液，持續(xù)通入95% O2和5% CO2的混合氣體保持pH在7.4，溫度維持在37 ℃。拉伸血管環(huán)，給予血管環(huán)2 mN的前負(fù)荷，利用Powerlab系統(tǒng)記錄血管張力的變化。平衡30 min后，加入60 mmol/L的高鉀溶液激活血管2次，待達(dá)到最大收縮效應(yīng)時(shí)，吸出高鉀溶液，用Kerbs液洗3次，每次5 min。然后加入3 μmol/L苯腎上腺素(Phe)預(yù)收縮血管，收縮達(dá)到穩(wěn)定值后加入乙酰膽堿(Ach)10-8～10-5mol/L或硝普鈉(SNP)10-9～10-5mol/L檢測(cè)血管內(nèi)皮依賴性或非依賴性舒張功能。

2 結(jié)果

2.1大鼠體重變化安慰劑組大鼠體重較對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；利拉魯肽干預(yù)組大鼠體重較安慰劑組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2血清TG、CHO、LDL、FBG、FINS變化安慰劑組血清TG、CHO、LDL、FINS較對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；利拉魯肽干預(yù)組，血清TG、CHO、LDL、 FINS較安慰劑組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3組大鼠FBG差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.73±0.48vs5.05±0.47vs4.84±0.51)；見表1。

2.3大鼠血管病理學(xué)改變光鏡下可見正常對(duì)照組大鼠血管組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)膜光滑平整，內(nèi)皮細(xì)胞扁平；中膜彈性纖維及平滑肌細(xì)胞排列整齊，未見平滑肌遷移；外層為疏松結(jié)締組織。安慰劑組血管內(nèi)膜明顯增厚，向腔面突起，內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，可見大量遷移的平滑肌細(xì)胞；中膜平滑肌細(xì)胞明顯增生且排列紊亂，并向內(nèi)膜遷移；外膜纖維結(jié)締組織增生明顯。利拉魯肽干預(yù)組血管內(nèi)膜向腔面呈指狀突起，內(nèi)皮細(xì)胞纖維化，內(nèi)皮下層可見遷移的平滑肌細(xì)胞，病變程度較安慰劑組明顯減輕。見圖1、2。

表1 大鼠體重及血清TG、CHO、LDL、FBG、FINS變化

與對(duì)照組比較：*P<0.05；**P<0.01；與安慰劑組比較：#P<0.05 ，##P<0.01

2.4血管張力檢測(cè)與正常對(duì)照組相比，安慰劑組大鼠腸系膜上動(dòng)脈的內(nèi)皮依賴性舒張顯著減弱；利拉魯肽干預(yù)組大鼠腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張較安慰劑組有所提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.820，P<0.05)。SNP引起的內(nèi)皮非依賴性舒張各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

2.5血清NO、ET-1變化與對(duì)照組相比，安慰劑組NO水平顯著降低，ET-1水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；利拉魯肽干預(yù)組，NO水平較安慰劑組顯著升高，ET-1水平較安慰劑組顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

3 討論

圖1 HE染色觀察各組大鼠腹主動(dòng)脈病理學(xué)變化

圖2 Masson染色觀察各組大鼠腹主動(dòng)脈病理變化

圖3 利拉魯肽在高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈硬化大鼠內(nèi)皮功能障礙中的作用

A:各組小鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張變化原始圖；B: 各組小鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張統(tǒng)計(jì)圖；C: 各組小鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)皮非依賴性舒張統(tǒng)計(jì)圖；與對(duì)照組比較：*P<0.05；與安慰劑組比較：#P<0.05

表2 血清NO、ET-1變化

與對(duì)照組比較：*P<0.05；與安慰劑組比較：#P<0.05

隨著人口老齡化，心腦血管疾病已成為威脅人類健康的慢性疾病之一，而動(dòng)脈硬化是心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素。長(zhǎng)期高脂飲食可導(dǎo)致糖脂代謝紊亂、大量游離脂肪酸進(jìn)入血液、內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂及胰島素抵抗，與動(dòng)脈硬化的形成密切相關(guān)[2]。在內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂和功能障礙的基礎(chǔ)上，血管平滑肌細(xì)胞增生和移行逐步演變成動(dòng)脈硬化改變。因此，保護(hù)血管內(nèi)皮功能是延緩動(dòng)脈硬化進(jìn)展的重要一步。

薈萃分析表明，利拉魯肽可減輕肥胖糖尿病患者的體重，且改善體質(zhì)量指數(shù)及腰圍。一項(xiàng)回顧性研究[3]顯示，針對(duì)肥胖的2型糖尿病患者予利拉魯肽治療后患者平均體重由(120±5)kg降至(115±3)kg。本研究顯示，與安慰劑組相比，利拉魯肽干預(yù)組大鼠體重顯著下降，亦提示利拉魯肽具有減輕體重的作用。LEAD研究結(jié)果表明，利拉魯肽干預(yù)后，血清TG、CHO、LDL均顯著下降。本研究顯示，高脂飲食大鼠予利拉魯肽干預(yù)后，血清TG、CHO、LDL較安慰劑組顯著下降，提示利拉魯肽具有降低血脂、改善脂代謝紊亂的作用。

臨床研究顯示，糖尿病患者頸動(dòng)脈厚度明顯增加，伴有內(nèi)膜下泡沫細(xì)胞數(shù)量增加，有早期粥樣斑塊形成，且與胰島素抵抗密切相關(guān)。研究[4]表明，高胰島素血癥能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。胰島素是一種很強(qiáng)的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可增加血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞的分裂和增殖，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)發(fā)生及動(dòng)脈硬化的進(jìn)展。本研究顯示，高脂組大鼠血清胰島素水平顯著升高，利拉魯肽干預(yù)組血清胰島素水平顯著降低，提示利拉魯肽能降低血清胰島素水平，改善胰島素抵抗，同時(shí)利拉魯肽的減重作用亦有助于改善胰島素抵抗。

Goto et al[5]體外研究顯示，內(nèi)皮損傷的小鼠被連續(xù)注射唾液素4后，發(fā)現(xiàn)新生血管內(nèi)膜的生成受到抑制，血管平滑肌細(xì)胞的增殖顯著降低，內(nèi)膜增厚減輕。本研究顯示，安慰劑組動(dòng)脈硬化模型大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，平滑肌細(xì)胞大量增生并遷移，伴有大量膠原纖維增生；與Goto et al[5]研究結(jié)果相似，利拉魯肽干預(yù)組內(nèi)皮排列較安慰劑組規(guī)整，平滑肌細(xì)胞增生及遷移程度較輕，膠原纖維增生不明顯，提示利拉魯肽可抑制平滑肌細(xì)胞增生和遷移，具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、改善動(dòng)脈硬化的作用。

在生理性刺激或藥物如乙酰膽堿的作用下，內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO等舒張因子引起內(nèi)皮依賴性舒張；在硝酸甘油、硝普鈉等作用下直接釋放NO引起不依賴于內(nèi)皮的血管舒張。內(nèi)皮功能紊亂最突出的表現(xiàn)是 NO 的合成減少，長(zhǎng)期的高脂血癥、高胰島素血癥可導(dǎo)致內(nèi)皮功能不全，同時(shí)NO活性降低，加速血管病變，導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂。國(guó)內(nèi)外臨床研究[6-7]顯示，血管內(nèi)皮損傷與ET-l、NO 等血管活性物質(zhì)的調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)。利拉魯肽可能對(duì)血管具有舒張作用，在加入一氧化氮抑制劑后，舒張幅度被抑制了75%，表明利拉魯肽可能通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO而產(chǎn)生舒張血管的作用[8]。本研究亦顯示，與安慰劑組相比，利拉魯肽干預(yù)組血清NO含量明顯升高，提示利拉魯肽可能通過增加NO水平保護(hù)內(nèi)皮功能。NO是作用最強(qiáng)的血管舒張因子，與之相反，ET-1是收縮血管能力最強(qiáng)的血管收縮因子，在調(diào)節(jié)血管張力方面具有重要作用。Khamaisi et al[9]研究發(fā)現(xiàn)，胰島素能增加內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶1的表達(dá)，使 ET-1的生成增加，而ET-1是引起血管收縮、代謝紊亂和細(xì)胞增殖等導(dǎo)致血管損傷發(fā)生的共同致病因素。本研究顯示，高脂組血清NO合成減少而ET-1增多，利拉魯肽干預(yù)后呈相反趨勢(shì)，提示利拉魯肽對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能具有保護(hù)作用。本研究進(jìn)一步評(píng)價(jià)動(dòng)脈硬化模型大鼠腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮舒張功能，結(jié)果提示高脂組大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能顯著減弱，提示脂代謝紊亂可引起內(nèi)皮依賴性舒張功能障礙，利拉魯肽干預(yù)組內(nèi)皮舒張功能較安慰劑組顯著改善，該結(jié)果與Basu et al[10]研究結(jié)果相似，均發(fā)現(xiàn)GLP-1對(duì)內(nèi)皮依賴性血管的舒張功能具有保護(hù)作用，可增加乙酰膽堿介導(dǎo)的血管舒張。

綜上所述，利拉魯肽不僅能夠安全有效的降糖和減重，而且可以調(diào)節(jié)脂代謝，具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮依賴性舒張功能的作用，提示利拉魯肽可能參與心腦血管的保護(hù)作用，但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和臨床研究，以佐證其潛在的價(jià)值。

[1] Gaspari T,Welungoda I,Widdop R E,et al.The GLP-1 receptor agonist liraglutide inhibits progression of vascular diseaseviaeffects on atherogenesis, plaque stability and endothelial function in an ApoE(-/-) mouse model[J].DiabVasc Dis Res,2013,10(4):353-60.

[2] Nahrendorf M,Swirski F K.Lifestyle effects on hematopoiesis and atherosclerosis[J]. Circ Res, 2015,116(5):884-94.

[3] Varanasi A,Patel P,Makdissi A,et al.Clinical use of liraglutide in type 2 diabetes and its effects on cardiovascular risk factors[J].Endocr Pract,2012,18(2):140-5.

[4] Del Turco S,Gaggini M,Daniele G,et al.Insulin resistance and endothelial dysfunction: a mutual relationship in cardiometabolic risk[J].Curr Pharm Des,2013,19(13):2420-31.

[5] Goto H,Nomiyama T,Mita T,et al.Exendin-4,a glucagon-like peptide-1 receptor agonist, reduces intimal thickening after vascular injury[J].Biochem Biophys Res Commun,2011,405(1):79-84.

[6] Wadden T A,Hollander P,Klein S,et al.Weight maintenance and additional weight loss with liraglutide after low-calorie-diet-induced weight loss: The SCALE Maintenance randomized study[J].Int JObes,2015,39(1):187.

[7] The potential risks of pancreatitis and pancreatic cancer with GLP-1-based therapies are far outweighed by the proven and potential (cardiovascular) benefits[J].Diabet Med,2013,30(10):1148-55.

[8] 李 寧,王 雄.利拉魯肽對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的血管舒張效應(yīng)及其機(jī)制研究[J].中國(guó)循環(huán)雜志,2015,30(1):50-3.

[9] Khamaisi M,Skarzinski G,Mekler J,et al.Hyperinsulinemia increases placenta endothelin-converting enzyme-1 expression in trophoblasts[J].Am J Hypertens,2012,25(1):109-14.

[10] Basu A,Charkoudian N,Schrage W,et al.Beneficial effects of GLP-1 on endothelial function in humans: dampening by glyburide but not by glimepiride[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab,2007,293(5): E1289-E1295.