何濟(jì)民，鄭曉梅，張 燁，黃 浩，官 明，江 涌，陳禮剛，劉 亮

顱腦創(chuàng)傷是病死率和致殘率最高的疾病之一。目前我國顱腦創(chuàng)傷的發(fā)病率在200～300/10萬人，且國內(nèi)外呈上升趨勢[1-2]。腦水腫是導(dǎo)致顱腦創(chuàng)傷患者后期死亡的關(guān)鍵因素。如何更好地認(rèn)識創(chuàng)傷后腦水腫發(fā)生發(fā)展機(jī)制及緩解創(chuàng)傷后腦水腫是顱腦創(chuàng)傷一直以來的重點(diǎn)。研究[3-5]表明，炎癥反應(yīng)與顱腦創(chuàng)傷密切相關(guān)，腦組織的炎癥反應(yīng)于顱腦創(chuàng)傷后幾分鐘即開始。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎癥因子對腦水腫發(fā)揮重要作用[6]。在創(chuàng)傷的腦細(xì)胞中TNF-α mRNA表達(dá)明顯增加，潛在地導(dǎo)致繼發(fā)性神經(jīng)元損傷[7-8]。細(xì)胞內(nèi)鈣超載是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的共同途徑，已經(jīng)證實(shí)在顱腦創(chuàng)傷后Ca2+通道拮抗劑的使用具有與治療性低溫相似的保護(hù)作用[9]；同時(shí)已發(fā)現(xiàn)Ca2+在TBI后腦細(xì)胞水腫及細(xì)胞死亡中具有重要作用[10]，下調(diào)鈣傳導(dǎo)蛋白表達(dá)顯著改善了TBI模型中的神經(jīng)元存活，更好地保留了神經(jīng)功能[11]。然而對于顱腦創(chuàng)傷所致腦水腫目前未見TNF-α與Ca2+相互作用的相關(guān)報(bào)道，該研究通過分別抑制TNF-α表達(dá)及腦細(xì)胞Ca2+超載來觀察相應(yīng)腦水腫程度，探究兩者在腦水腫中的作用及相關(guān)機(jī)制，為創(chuàng)傷后腦水腫提供新的線索。

1 材料與方法

1.1動物選擇健康清潔級SD大鼠(雌雄無異)80只，體質(zhì)量250～300 g，由西南醫(yī)科大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2試劑TNF-α 抑制劑(環(huán)戊苯吡酮)由美國MEC公司提供；Ca2+通道阻滯劑(尼莫地平注射液)由德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司提供；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、RIPA總蛋白裂解液、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、抗體洗脫液、顯影定影液、脫脂奶粉均由阿斯本生物公司提供；蛋白酶抑制劑由上海玉博生物科技有限公司提供；RNA提取試劑盒、標(biāo)記蛋白由賽默非世爾科技(中國)有限公司提供。

1.3制作顱腦創(chuàng)傷動物模型將大鼠隨機(jī)分成4組：空白對照組、單純處理組、環(huán)戊苯吡酮(TNF-α抑制劑)處理組、尼莫地平處理組。創(chuàng)傷處理模型參照Feeney’s自由落體模型設(shè)計(jì)制作[12]。將大鼠用3%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后，俯臥位置于大鼠立體定位儀平臺上，固定頭部。備皮消毒后，沿右側(cè)顱頂旁正中切口，分離骨膜，用簡易顱骨鉆在前囪后1.5 mm，中線旁2 mm處鉆一直徑約4 mm的骨窗，保持硬腦膜完整，將撞桿頭端置于骨窗硬膜外，用100 g重的擊錘從50 cm高處自由墜落沖擊撞桿，撞擊能量為500 J，造成顱腦損傷，適量骨蠟填縫骨窗及縫合切開,制作大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型。單純處理組只單純創(chuàng)傷處理；環(huán)戊苯吡酮處理組于創(chuàng)傷后立即給予環(huán)戊苯吡酮(1 mg/100 g)，以后每24 h同量腹腔給予1次，持續(xù)3 d；尼莫地平處理組于創(chuàng)傷后立即給予尼莫地平(0.5 mg/kg)，以后每24 h同量腹腔給予一次，持續(xù)3 d。

1.4影像學(xué)檢查及腦組織取材各組大鼠MRI采集影像后頸椎脫臼處死，根據(jù)MRI提示定位取出創(chuàng)傷區(qū)域腦組織，每組大鼠腦組織分別取材檢測TNF-α、AQP-4與Ca2+。

1.5腦組織TNF-α、AQP-4檢測

1.5.1Western blot法檢測各組TNF-α、AQP-4蛋白表達(dá)量 創(chuàng)傷區(qū)域取材的腦組織塊用預(yù)冷的PBS 緩沖液漂洗后剪成芝麻大小小塊，按照組織蛋白提取試劑中的步驟提取總蛋白溶液。使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。根據(jù)樣品濃度確定上樣量，然后依次點(diǎn)樣、電泳、孵育抗體、曝光檢測，最后AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.5.2Real-time PCR法檢測TNF-α、AQP-4 mRNA表達(dá)量 創(chuàng)傷區(qū)域取材的腦組織塊于液氮中保存，于1 ml 預(yù)冷的TRIzol中充分研磨，依次按步驟提取RNA，第一鏈cDNA的合成采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行(日本TaKaRa公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在Life technologies公司的StepOneTMReal-Time PCR儀上完成，每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行(日本TaKaRa公司)，最后采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5.3免疫組化檢測TNF-α、AQP-4表達(dá)量 腦組織取材后依次經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、切片、烘片、微波修復(fù)、封閉后，每張切片加入約50 μl稀釋的兔抗鼠一抗覆蓋組織，4 ℃過夜，PBS清洗，去除PBS液，每張切片加50～100 μl山羊抗兔二抗，37 ℃孵育50 min。清洗后用DAB溶液顯微鏡控制顯色。顯色完全后，蘇木精復(fù)染，氨水返藍(lán)，流水沖洗，梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封固后置于顯微鏡下取圖。

1.6腦組織Ca2+檢測各組大鼠腦組織取出后立即用PBS沖洗2次，并于PBS中剪成糊狀，轉(zhuǎn)移至離心管離心，離心后加入0.25%胰酶于37 ℃恒溫水浴箱中消化40 min ，每隔5 min 吹打1次，消化完畢后加入等量DMEM培養(yǎng)液終止消化，以1 000 r/min離心10 min，去除上層液體，加入PBS，吹打均勻后通過300目細(xì)胞篩，取通過細(xì)胞篩后液體，1 000 r/min離心機(jī)中離心5 min，棄掉上清液，然后加入完全DMEM培養(yǎng)液，獲得腦組織單細(xì)胞懸液。取100 μl腦組織懸液用苔盼藍(lán)染色后上鏡檢測細(xì)胞存活率，若細(xì)胞存活率>95%，為合格的單細(xì)胞懸液，可以備用。將備用單細(xì)胞懸液放入4 ℃臺式離心機(jī)以3 000 r/min離心5 min，離心后去掉上清液，加入GENMED裂解液充分混勻，轉(zhuǎn)移入預(yù)冷離心管強(qiáng)力旋渦震蕩15 s ，置于冰槽孵育30 min后于4 ℃離心機(jī)15 000 r/min離心10 min，抽取上清液待檢，將待檢液按照試劑盒說明順序進(jìn)行吸光度檢測各組標(biāo)本吸光度值，然后根據(jù)公式計(jì)算檢測的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度：檢測樣品濃度=標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)鈣濃度(mmol/L)×樣品稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1各組Ca2+濃度比較結(jié)果顯示，4組腦組織中單純處理組Ca2+濃度最高，其次為環(huán)戊苯吡酮處理組、尼莫地平處理組，空白對照組Ca2+濃度最低，見圖1。

圖1 各組腦組織中細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度

A：空白對照組；B：單純處理組；C：環(huán)戊苯吡酮處理組；D：尼莫地平處理組；與單純處理組比較：**P<0.01

2.2各組創(chuàng)傷區(qū)腦組織中TNF-α表達(dá)經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳后可見TNF-α和GAPDH兩條帶分別為16 ku和37 ku，4組中均有表達(dá)。與單純處理組相比，環(huán)戊苯吡酮處理組TNF-α蛋白表達(dá)量明顯降低了52.58%(F=1.41，P<0.01)，但仍明顯高于空白對照組，說明TNF-α抑制劑環(huán)戊苯吡酮可以降低創(chuàng)傷腦組織中TNF-α蛋白的表達(dá)；與單純處理組相比，尼莫地平處理組TNF-α蛋白表達(dá)量變化不大(F=1.30，P>0.05)，提示Ca2+通道阻滯劑尼莫地平并不能降低創(chuàng)傷腦組織中TNF-α蛋白的表達(dá)。

各組腦組織TNF-α mRNA表達(dá)情況：與單純處理組擴(kuò)增倍數(shù)相比，環(huán)戊苯吡酮處理組明顯降低(F=1.95，P<0.01)，同樣說明TNF-α抑制劑可以降低創(chuàng)傷腦組織中TNF-α mRNA的表達(dá)；與單純處理組相比，尼莫地平處理組變化不大(F=2.67，P>0.05)，同樣說明Ca2+通道阻滯劑并不能降低創(chuàng)傷腦組織中TNF-α mRNA的表達(dá)。見圖2。

圖2 Western blot法檢測各組腦組織內(nèi)TNF-α蛋白表達(dá)量

A：空白對照組；B：單純處理組；C：環(huán)戊苯吡酮處理組；D：尼莫地平處理組；與單純處理組比較：**P<0.01

2.3各組創(chuàng)傷區(qū)腦組織中AQP-4表達(dá)不同處理組中創(chuàng)傷腦組織經(jīng)Western blot蛋白檢測可見，與單純處理組相比，環(huán)戊苯吡酮處理組明顯降低，尼莫地平處理組也明顯降低(F=1.32、4.12，P<0.01)，但較空白對照組仍較高。說明TNF-α抑制劑環(huán)戊苯吡酮和Ca2+通道阻滯劑尼莫地平均可以一定程度影響創(chuàng)傷腦組織中AQP-4蛋白的表達(dá)，見圖3。

由圖3、4可見，AQP-4在4組中均有表達(dá)，空白對照組AQP-4表達(dá)最低，單純處理組最高，環(huán)戊苯吡酮處理組、尼莫地平處理組較單純處理組均明顯降低，但較空白對照組仍高；圖4為各組腦組織AQP-4表達(dá)情況，與圖5各組腦組織AQP-4基因表達(dá)情況相比，各組對比變化趨勢大致相同，且空白對照組、環(huán)戊苯吡酮處理組、尼莫地平處理組各組與單純處理組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)單純處理意義，環(huán)戊苯吡酮處理組和尼莫地平處理組較單純處理組AQP-4表達(dá)明顯降低。說明TNF-α抑制劑環(huán)戊苯吡酮和Ca2+通道阻滯劑尼莫地平均可以抑制水腫蛋白在腦組織中的表達(dá)。

圖3 Western blot法檢測各組腦組織內(nèi)AQP-4蛋白表達(dá)量

A：空白對照組；B：單純處理組；C：環(huán)戊苯吡酮處理組；D：尼莫地平處理組；與單純處理組比較：**P<0.01

圖4 各組腦組織中AQP-4基因擴(kuò)增對比

A：空白對照組；B：單純處理組；C：環(huán)戊苯吡酮處理組；D：尼莫地平處理組；與單純處理組比較：**P<0.01

2.4各組大鼠腦組織免疫組化結(jié)果圖5、6分別為各組大鼠腦組織TNF-α、AQP-4的免疫組化圖，箭頭所指為目標(biāo)染色所在。圖5可見經(jīng)TNF-α抑制劑處理的大鼠腦組織TNF-α表達(dá)比單純創(chuàng)傷大鼠有明顯降低，尼莫地平處理組較單純處理組似乎變化不大；圖6可見經(jīng)環(huán)戊苯吡酮和尼莫地平處理過的大鼠腦組織較單純處理組腦組織AQP-4均明顯減少。此結(jié)果與Western blot、PCR檢測結(jié)果一致。

圖5 TNF-α的免疫組化圖 蘇木精染色×400

A空白對照組；B：單純處理組；C：環(huán)戊苯吡酮處理組；D：尼莫地平處理組

圖6 AQP-4的免疫組化圖 蘇木精染色×400

A：空白對照組；B：單純處理組；C：環(huán)戊苯吡酮處理組；D：尼莫地平處理組

2.5各組大鼠腦組織影像學(xué)檢測結(jié)果圖7A為正常大鼠顱腦影像，圖7B為單純處理組大鼠腦組織影像，創(chuàng)傷后未經(jīng)任何處理，傷后3 d 可見腦組織水腫仍較明顯；圖7C為經(jīng)TNF-α抑制劑環(huán)戊苯吡酮處理過，傷后3 d 影像最大水腫層面比(4.26±0.61)/(24.6±0.97)提示較單純創(chuàng)傷組最大水腫層面比(8.74±1.09)/(24.5±0.85)明顯減小，有好轉(zhuǎn)(F=3.98，P<0.01)，說明抑制TNF-α表達(dá)可以降低腦水腫；圖7D為經(jīng)鈣通道阻滯劑尼莫地平處理過后影像，最大水腫層面比(3.78±0.72)/(24.4±0.64)同樣提示較單純處理組最大水腫層面比(8.74±1.09)/(24.5±0.85)明顯減小，水腫有好轉(zhuǎn)(F=2.30，P<0.01)，說明抑制鈣通道可以降低腦水腫。見圖7。

3 討論

圖7 各組大鼠腦組織MRI檢查

A：空白對照組；B：單純處理組；C：環(huán)戊苯吡酮處理組；D：尼莫地平處理組

急性顱腦損傷后繼發(fā)性腦水腫程度對患者預(yù)后至關(guān)重要，許多炎性因子參與了顱腦創(chuàng)傷后腦水腫過程。創(chuàng)傷后炎性細(xì)胞因子在腦組織中過表達(dá)，使神經(jīng)元賴以生存的環(huán)境改變，可導(dǎo)致神經(jīng)元變性[13]。TNF-α是參與顱腦創(chuàng)傷后腦水腫重要的炎癥因子，在顱腦創(chuàng)傷早期及繼發(fā)性炎癥反應(yīng)中高表達(dá)，過度炎性反應(yīng)時(shí)，TNF-α可改變血管內(nèi)壁通透性，釋放大量自由基，促發(fā)細(xì)胞毒性腦水腫，增加血腦屏障通透性，誘發(fā)腦水腫、炎癥壞死及腦部微循環(huán)障礙[14]。研究[6]證明在不同程度顱腦損傷后第5天為TNF-α表達(dá)量高峰，并且其表達(dá)量與水腫程度呈相關(guān)性。同時(shí)，Ca2+是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、細(xì)胞間通訊、酶活性、膜通透性、細(xì)胞代謝和多種蛋白激酶的活化中具有重要作用。細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度存在很大差異，維持細(xì)胞內(nèi)外鈣濃度穩(wěn)定是細(xì)胞各項(xiàng)功能正常的基礎(chǔ)，細(xì)胞內(nèi)鈣超載是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的重要途徑[15]。許多研究都已證明這兩者在顱腦創(chuàng)傷后腦水腫中都起著重要作用。為探討兩者在創(chuàng)傷后腦水腫中的相關(guān)性及兩者是否存在信號通路上的聯(lián)系，筆者通過不同藥物處理分別減少TNF-α和Ca2+在創(chuàng)傷后腦組織中的含量來控制實(shí)驗(yàn)組。

已有研究[16-18]證明，創(chuàng)傷后腦組織AQP-4表達(dá)量與腦水腫嚴(yán)重程度呈直線關(guān)系，所以可以通過AQP-4表達(dá)量及影像學(xué)等客觀指標(biāo)來探究不同因素影響下創(chuàng)傷后腦水腫的情況。通過對空白對照組和單純處理組兩組各指標(biāo)及影像學(xué)的對比，顯示在顱腦創(chuàng)傷后可出現(xiàn)腦水腫，創(chuàng)傷后組腦組織中TNF-α和AQP-4表達(dá)量及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯增加，這說明TNF-α、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及AQP-4與創(chuàng)傷后腦水腫具有相關(guān)性；通過TNF-α抑制劑環(huán)戊苯吡酮處理后，再與單純處理組比較，結(jié)果顯示采用環(huán)戊苯吡酮處理組的創(chuàng)傷腦組織TNF-α、AQP-4表達(dá)量及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度都降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)影像學(xué)提示環(huán)戊苯吡酮處理創(chuàng)傷組腦水腫較單純處理組有明顯降低，這說明在顱腦創(chuàng)傷后TNF-α的表達(dá)可影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及AQP-4表達(dá)量；采用Ca2+通道阻滯劑尼莫地平處理后，通過與單純處理組比較，結(jié)果顯示，采用尼莫地平處理的腦組織細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及AQP-4表達(dá)量明顯降低，影像學(xué)也提示腦水腫較單純處理組有明顯降低；但其處理后的腦組織中TNF-α的表達(dá)量與單純創(chuàng)處理相比并沒有明顯變化；這種現(xiàn)象提示在創(chuàng)傷后腦組織中Ca2+濃度的變化可以影響腦組織中AQP-4的表達(dá)及影響腦水腫，但并不能影響腦組織中TNF-α的表達(dá)。

綜上，創(chuàng)傷后腦組織中TNF-α、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化都可以影響腦水腫的變化，且在相互影響上，TNF-α和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化是單向作用的，TNF-α表達(dá)可以影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化，但是細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化并不能影響組織中TNF-α表達(dá)。提示在顱腦創(chuàng)傷后TNF-α對腦水腫的影響可能是通過TNF-α影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度來調(diào)節(jié)AQP-4表達(dá)量，從而參與顱腦創(chuàng)傷后腦水腫的發(fā)生；在影響腦水腫的信號通路中TNF-α可能是Ca2+的上游信號。這為進(jìn)一步治療創(chuàng)傷后腦水腫提供新的依據(jù)。

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