黃 斌，陶小根，陳 劍，陳 超，葉山東

近年來隨著經濟的發(fā)展和生活方式的改變，肥胖的發(fā)病率逐年增高，已成為研究的熱點。肥胖不僅是2型糖尿病及高血壓的獨立危險因素，亦是慢性腎臟疾病的獨立危險因素，在早期階段表現(xiàn)為高濾過、高灌注和腎體積肥大，并可見微量白蛋白尿；隨著病情的進一步發(fā)展分別表現(xiàn)為肥胖相關性局灶節(jié)段性腎小球硬化；最后均發(fā)展為終末期腎衰竭[1]。要防治肥胖引起的腎損害，應盡量在發(fā)病早期進行干預，延緩或阻斷腎損害的進一步進展的通路。氧化應激是一種機體內的失平衡狀態(tài)，越來越多的證據(jù)顯示，高脂肪的飲食結構、脂肪組織的堆積可顯著加重哺乳動物體內的氧化應激水平，從而對各組織細胞中的生物大分子造成氧化損傷[2]。在肥胖、高胰島素血癥、高脂血癥等一些病理條件下，過量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)或者減弱的抗氧化防御均導致機體內氧化應激形成，進而對損傷全身很多器官[3]。

芹菜素(apigenin)是一種天然的黃酮類化合物，具有低毒性和無誘變性等特點，近年來，大量研究[4-5]表明，芹菜素具有多項藥理作用和生物學特性，主要包括抗癌、心腦血管保護作用、抗炎、抗氧化、抗病毒等作用。肥胖狀態(tài)下，炎癥因子的表達上調，而芹菜素則可以逆轉這種現(xiàn)象，同時使單核細胞、巨噬細胞和成纖維細胞的TNF-α表達下調，并抑制NF-κB的活化[6]。該實驗設計擬證實芹菜素改善肥胖大鼠腎臟中氧化應激、炎癥代謝紊亂狀態(tài)并進一步探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1動物模型建立及干預方法4周齡雄性SD大鼠，由上海斯萊克實驗動物中心提供。按隨機數(shù)字表法分為對照組和高脂組。對照組予普通飼料(熱量比：蛋白質26%，碳水化合物64%，脂肪10%)，高脂組予高脂飼料(熱量比：蛋白質14%，碳水化合物32%，脂肪54%)喂養(yǎng)。連續(xù)高脂喂養(yǎng)12周后，在高脂組篩選出造模成功的肥胖大鼠(體重較普食對照組增加20%以上)，按隨機數(shù)字表法隨機分組：干預組(Apigenin組，n=5)、肥胖組(Obesity組，n=5)。另外，加上對照組(Con組，n=5)，共3組。分別予以不同干預：① 對照組：0.9%生理鹽水灌胃，連續(xù)4周；② 肥胖組：0.9%生理鹽水灌胃，連續(xù)4周；③ Apigenin組：40 mg/(kg·d)芹菜素(0.9%生理鹽水配制)灌胃，連續(xù)4周。

1.2大鼠組織標本留取大鼠完成各種干預48 h后，空腹12 h，以水合氯醛腹腔注射處死，留取血清以及雙側腎臟，立即液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱待測。

1.3免疫組化組織樣本經PBS緩沖液漂洗后，4%多聚甲醛溶液固定。經梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、按免疫組化試劑盒染色、洗脫、透明、封片后鏡檢并在200倍顯微鏡視野下照相。

1.4Westernblot檢測目的蛋白表達在冰上用勻漿器將腎臟組織打碎，提取總蛋白，并以BCA法測定蛋白濃度。進行10% SDS-PAGE凝膠電泳150 min，轉至PVDF膜。室溫下用7.5%脫脂牛奶封閉1 h，然后與相應抗體LC3B(杭州碧云天公司)；SOD2、iNOS(美國abcam公司)；p-P67、p-P65(美國Santa Cruz公司)；Beclin1、β-actin(南京巴傲德公司)。4 ℃孵育過夜；次日以TBST緩沖液洗膜5次，每次間隔5～10min，與相應二抗孵育1 h；暗室中以ECL試劑顯影(美國Millipore公司)，應用image-pro plus6.0軟件分析目的蛋白與內參β-actin灰度值后計算相對值，以相對值進行統(tǒng)計學比較。

1.5腎臟組織DHE探針染色新鮮腎臟組織取出后經OCT膠包埋后置于-20 ℃冰凍后制作冰凍切片，切片在室溫、避光環(huán)境下與5 μmol/L二氫乙啶(DHE)探針溶液孵育30 min，孵育完成后，PBS緩沖液充分漂洗切片、晾干后，在熒光顯微鏡上以Zeiss 573～637 nm波長濾鏡原位觀察熒光信號。照片拍攝完成后，采用ImageJ (V1.48,USA) 軟件進行分析。每一個腎臟樣品，從制作切片到最后拍照，整個過程同步進行。

2 結果

2.1芹菜素對肥胖大鼠體重的影響肥胖以及其伴隨而來的全身慢性低度炎癥是引起全身代謝異常的重要原因。本實驗高脂喂養(yǎng)12周成肥胖模型，再經過4周的芹菜素干預治療后，相較肥胖組相比，芹菜素組體重有一定的下降趨勢，但是差異無統(tǒng)計學意義[芹菜素組(508.33±34.30)g，肥胖組(536.00±40.65)g，t=1.80，P=0.096]，見表1。

2.2芹菜素對肥胖大鼠腎臟代謝紊亂狀態(tài)的影響細胞清除自由基的能力受損后導致ROS過量，引起氧化應激。為研究大鼠腎臟中的ROS含量，用O2-(ROS的一種)探針DHE對腎臟組織冰凍切片進行原位染色。結果顯示，肥胖組大鼠腎臟熒光信號明顯增強，而芹菜素治療后的冰凍切片熒光信號顯著減弱(圖1)。這一結果表明，持續(xù)攝入芹菜素能夠有效地減輕肥胖所導致的腎臟氧化應激。通過Western blot檢測顯示，肥胖可引起腎臟組織中p67phox、iNOS、p-p65的蛋白表達顯著升高；SOD2明顯下降，經過4周的芹菜素治療之后，均出現(xiàn)不同程度的逆轉(圖2、表2)。以上結果均提示芹菜素可一定程度的改善肥胖引起的大鼠腎臟氧化應激以及炎癥狀態(tài)。

表1 芹菜素干預前后各組大鼠的體重變化

與對照組比較：*P<0.05

圖1 腎臟組織切片DHE染色后熒光強度 ×200

A：對照組； B：肥胖組；C：干預組； D：IPP 6.0 軟件程序用于圖像熒光強度分析，與對照組比較：*P<0.05, 與肥胖組比較：#P<0.05

圖2 芹菜素對肥胖大鼠腎臟代謝紊亂狀態(tài)的影響

表2 各組大鼠腎臟相關蛋白表達比較

與對照組相比：*P<0.05；與肥胖組相比：#P<0.05

2.3芹菜素對肥胖大鼠腎臟自噬的影響作為自噬過程的標志性分子，與對照組大鼠相比，肥胖組腎臟中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白含量并無明顯變化。芹菜素治療28 d后，兩者表達顯著上升(圖3D、表2)。進一步通過免疫組化檢測了LC3在腎臟中的表達，結果與Western blot的檢測結論相一致(圖3A、3B、3C),即芹菜素可激活肥胖大鼠腎臟中的自噬通路。

圖3 芹菜素對肥胖大鼠腎臟自噬的影響 ×200

A：對照組的LC3免疫組化結果；B：肥胖組的LC3免疫組化結果；C：干預組的LC3免疫組化結果；D：Beclin1和LC3蛋白Western blot結果

3 討論

現(xiàn)代社會久坐不動的生活方式以及高能量食物不斷進入日常飲食中， 造成人體能量攝入過多誘發(fā)體重增加，導致肥胖癥的發(fā)病率不斷攀升。肥胖的迅速流行使其已經成為影響全球人口健康最主要的疾病之一[7]。流行病學調查顯示，肥胖和超重與微量白蛋白尿顯著相關[8]。有研究[9]認為 BMI 和腎臟病危險因素相關， BMI 增加使未來 20 年患腎臟病風險增加 20%。美國腎臟早期評估計劃(KEEP)指出，肥胖是多種途徑導致慢性腎臟病的疾病狀態(tài)并且患者的腎臟損害與肥胖程度相關[10]。

肥胖被認為是一種系統(tǒng)性的亞急性炎癥狀態(tài)，肥胖機體低水平的內毒素血癥、脂肪組織的局部炎癥以及系統(tǒng)性炎癥是肥胖相關疾病的共同驅動因素。大量研究[11]表明肥胖機體涉及抗氧化機制的損傷。芹菜素在過去的幾十年里，其藥理作用逐漸被揭示。眾多研究[12]表明，芹菜素可通過抑制炎癥因子釋放、改善脂質紊亂、改善氧化應激等進而緩解各種疾病。肥胖病理條件下機體可產生過量的ROS，從而引起組織器官損傷，抗氧化防御系統(tǒng)則在預防該應激損傷中發(fā)揮著主要作用。為探究ROS的增加是否與機體降低的抗氧化能力有關，本研究檢測了與ROS清除密切相關的重要抗氧化酶SOD2、p-P67的蛋白表達水平以及腎臟內的炎癥狀態(tài)指標iNOS、p-P65。實驗結果提示芹菜素能明顯改善肥胖引起的腎臟內氧化應激和炎癥的增加，并且這種保護作用不依賴于降低機體的體重。

細胞自噬是從真核細胞到哺乳動物高度保守的重要亞細胞事件之一 ，當細胞處于應激情況下自噬過程可將胞內損傷蛋白或細胞器包裹形成自噬泡，之后與溶酶體融合降解其中生物大分子 ，進而重新被細胞利用。Lenoir et al[13]證實腎臟足細胞 Atg5 特異性敲除后，小鼠自噬功能減弱，使得高齡小鼠體內氧化蛋白蓄積，出現(xiàn)內質網應激和蛋白尿，最終導致足細胞損傷、 丟失及腎小球硬化。Kitada et al[14]發(fā)現(xiàn)2型糖尿病模型 Wistar 大鼠腎組織自噬通路受抑制，近端腎小管細胞出現(xiàn)線粒體損傷。Pallet et al[15]證實環(huán)孢素通過激活腎小管上皮細胞的自噬活性， 在環(huán)孢素處理早期自噬激活可起到保護腎小管上皮細胞的作用，減輕其對腎小管上皮細胞的毒性作用。在糖尿病腎病模型中，自噬活性較正常組明顯下降，提示自噬可能參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[16]。前人的研究結果均提示，自噬在腎臟功能的保護有一定的作用。近年來，芹菜素對自噬活性的提升尤其在炎癥背景下逐步被人們揭示[17]。在本研究中，經過4周的芹菜素干預治療肥胖大鼠腎臟內的自噬關鍵分子LC3、Beclin1的蛋白表達較肥胖組明顯提升，LC3免疫組化也印證了Western blot結果。綜上，芹菜素改善了肥胖導致的大鼠腎臟氧化應激、炎癥增加，這種改善作用可能與激活自噬通路有關。

本研究肥胖組自噬活性較對照組差異并無統(tǒng)計學意義，一方面此批大鼠成模率較低，可能其對肥胖的耐受性較好，故體內的炎癥損傷的強度尚不足以出現(xiàn)引起自噬抑制；另一方面實驗模擬的是肥胖早期狀態(tài)，肥胖組大鼠成模時間短，故體內的炎癥持續(xù)時間亦較短，延長肥胖成模時間，自噬通路可能會較對照組出現(xiàn)顯著的變化。

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