牛 楊，申才良，宋旆文，劉曉穎

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)可導致嚴重的神經系統(tǒng)疾病，給個人家庭和社會造成巨大負擔。神經干細胞(neural stem cells，NSCs)是一類細胞，不僅可以自我復制，而且具有分化成多種神經細胞的潛力[1]。研究[2]表明，NSCs可以分化為有助于損傷后脊髓組織修復的神經元。這一發(fā)現(xiàn)表明脊髓損傷后的功能恢復是可能的。然而，由于脊髓損傷后的氧化應激環(huán)境，移植入體內的NSCs很難存活[3]。因此，減少氧化應激損傷成為NSCs治療SCI的關鍵一環(huán)。

目前許多研究已經證明骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells ，BMSCs)對SCI的治療作用。有學者發(fā)現(xiàn)BMSCs旁分泌液具有有效的免疫調節(jié)和抗氧化應激特性[4-5]。然而，其主要機制尚不清楚。有研究[6]指出Notch信號通路在控制細胞增殖和凋亡中發(fā)揮關鍵作用。因此在該研究中，將著重研究骨髓間充質干細胞條件培養(yǎng)基(bone mesenchymal stem cell conditional medium，BMSC-CM)對體外H2O2誘導的NSCs的保護作用，以及Notch1信號通路(Notch1 signaling pathway, Notch1)在NSCs的氧化應激反應中的作用以及BMSC-CM的保護機制是否與Notch1相關聯(lián)。

1 材料與方法

1.1動物和試劑SD大鼠獲自安徽醫(yī)科大學實驗動物科學研究所；表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibrob last growth factor，bFGF)購自美國PeproTech公司；DMEM和DMEM / F12購自美國 Gibco BRL公司；B27購自美國Invitrogen公司；胎牛血清(FBS)購自美國HyClone公司；GFAP和MAP-2抗體、左旋多聚賴氨酸購自美國Sigma公司；細胞巢蛋白抗體 (Nestin) 、DAPT購自美國Santa Cruz公司；膜聯(lián)蛋白V-FITC / PI凋亡檢測試劑盒購自美國Becton Dickinson公司。

1.2神經干細胞的培養(yǎng)取24～48 h的SD小鼠，酒精消毒后脫臼處死，取出完整腦組織。使用解剖顯微鏡小心地剔除腦膜。將組織切成小塊，加入胰酶消化液，而后放入恒溫箱中7 min，隨后取出切碎的組織在巴斯德吸管中研磨。研磨后的組織通過濾網過濾，然后以1 000 r/min離心5 min，去除上清液，重懸沉淀，再次以1 000 r/min離心5 min，而后將沉淀的組織重新懸浮于增殖培養(yǎng)基(含有2%B27補充劑，20 ng/ml EGF和10 ng/ml bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基)中。然后，將細胞以105個細胞/ml的方式接種在燒瓶中，然后將細胞放在恒溫箱中進行孵育。每4 d更換一次培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)7 d后，其增殖并形成懸浮的神經球，其直徑約為100 μm。然后，吹散神經球，對神經干細胞進行傳代培養(yǎng)。按照相同的程序培養(yǎng)第2代神經球。當細胞增殖并形成達到直徑約為100 μm的懸浮神經球時，將細胞用于實驗。將第2代神經球移植到用聚-L-賴氨酸上油的蓋玻片上。然后通過免疫細胞化學鑒定NSCs。在神經球中發(fā)現(xiàn)巢蛋白陽性的許多細胞(圖1A)。

1.3培養(yǎng)細胞的分化免疫熒光染色實驗應用免疫細胞化學技術檢測細胞的MAP-2表達。將傳代培養(yǎng)7 d后的神經干細胞吹散，而后接種在被多聚甲醛浸潤過得撥片上，而后加入培養(yǎng)液，每3 d更換一次培養(yǎng)液，7 d后向培養(yǎng)物中加入4%多聚甲醛，使培養(yǎng)物在室溫下靜置15～20 min。 然后，將培養(yǎng)物用PBS洗滌3次,每次5 min。 細胞用含有10%正常山羊血清的0.3%Triton-X100處理以在室溫下封閉非特異性抗原30 min。 然后，將培養(yǎng)物與抗MAP-2在4 ℃環(huán)境下過夜。 第2天，將培養(yǎng)物用PBS洗滌3次,每次5 min。 將特異性二抗加入到培養(yǎng)物中，并將培養(yǎng)物在37 ℃下孵育40～60 min。 然后將細胞用PBS洗滌3次,每次5 min，并使用DAPI在室溫下染色細胞核5～10 min。 最后，將載玻片用PBS漂洗3次，并用熒光顯微鏡成像。 使用相同的方法染色GFAP(圖1)。

1.4制備BMSCs及其條件培養(yǎng)基使用戊巴比妥鈉用于處死大鼠。然后，從脛骨和股骨收集骨髓基質干細胞。將收集的組織懸浮液以1 000 r/min離心5 min以溶解紅細胞。然后，使用Krebs緩沖液和0.83%NHCL4的混合物在4 ℃下將沉積的細胞重新懸浮10 min。然后將組織洗滌2次，并以1 000 r/min將培養(yǎng)物離心5 min。接下來，將沉淀的細胞重新懸浮在含有20%FBS的DMEM中。將細胞以106個細胞/ ml接種在玻璃燒瓶中。使用細胞培養(yǎng)箱孵育BMSCs(37 ℃、5% CO2)。 48 h后更換培養(yǎng)基，每4 d更換一次。當細胞貼壁達到至少80%以上時，使用胰酶對間充質干細胞進行消化重懸，重復上述離心步驟，最后再以105個細胞/ ml將它們重新接種在玻璃燒瓶中。當細胞傳至第3代時，貼壁率達90%時，使用倒置顯微鏡觀察其形態(tài)。流式細胞儀鑒定BMSCs[7]。而后將培養(yǎng)基從玻璃燒瓶中取出，玻璃燒瓶用Krebs緩沖液洗滌3次。最后，用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)BMSCs 24 h，而后倒出培養(yǎng)液，并使用直徑0.22 μm的孔濾器獲得所得條件培養(yǎng)基。

1.5細胞分組和處理將NSCs分為4組后進行編號，分別接種于24孔板中，每孔約1 ml，第一組為對照組，加入等量PBS，第二組為H2O2處理組(50、100、200 μmol/L)，測定不同濃度H2O2對NSCs的影響，第三組為H2O2(100 μmol/L)處理組+DAPT組(5、10、20 μmol/L)，測定不同濃度DAPT對損傷后NSCs的影響，第四組為H2O2(100 μmol/L)處理組+BMSC-CM組(50、100、200 μmol/L)，測定不同濃度BMSC-CM對損傷后NSCs的影響。各組均在37 ℃、5%溫箱中培養(yǎng)2 h，而后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6細胞凋亡分析通過FITC-Annexin V / PI染色試劑盒檢測神經干細胞的凋亡。在H2O2處理2 h后，通過離心(1 000 r/min、5 min)收獲細胞。然后，用冰冷的PBS洗滌細胞2次。然后將細胞與FITC(5 μl)和PI(5 μl)染色試劑盒在室溫下避光環(huán)境中孵育15 min。然后使用流式細胞儀分析細胞。數(shù)據(jù)由FACStation數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)和Cell Quest軟件(美國，Becton Dickinson，San Jose公司)分析。

1.7Westernblot分析通過在2 000 r/min離心5 min(室溫)收集細胞。然后將樣品裂解。將樣品緩沖液加入樣品中(樣品 ∶樣品緩沖液=體積比為4 ∶1)。然后，將樣品重新懸浮并煮沸(5 min,95～100 ℃)。接下來，在室溫下以1 200 r/min離心樣品2 min。收集所得上清液進行Western blot分析。然后將上清液轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)上。隨后用5%的無脂牛奶在室溫下封閉膜2 h。然后將膜與結合的抗Notch1(1 ∶200)，抗Hes1 (Hairy and enhancer of split 1,Hes1)(1 ∶200)，抗B細胞淋巴瘤蛋白2(B cell lymphoma 2，Bcl-2)(1 ∶200)，抗Bcl-2相關蛋白(Bcl-2 assaciated X protein，Bax)(1 ∶200)，抗含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶3蛋白(Cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3)(1 ∶200)，抗含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶9蛋白(Cysteinyl aspartate specific proteinase 9，Caspase-9)(1 ∶200)和抗β-肌動蛋白(1 ∶1 000)過夜。第2天，用TBST洗滌膜4次。然后將膜在二次抗體(1 ∶4 000稀釋)中在室溫下溫育2 h。之后，用TBST洗滌膜4次，共10 min。最后，使用SuperSignal West Femto最大靈敏度底物檢測系統(tǒng)(美國Pierce公司)來觀察免疫反應帶。使用Epson V200和Quantity One分析結果。

2 結果

2.1大鼠NSCs鑒定體外分離的神經干細胞培養(yǎng)7 d后，可見細胞聚集成球生長，選取貼壁后的神經球細胞行神經干細胞特異性蛋白Nestin熒光染色檢測，結果見圖1A，見Nestin陽性表達。MAP-2為神經元細胞特異性蛋白，GFAP為神經膠質細胞特異性蛋白，對貼壁分化培養(yǎng)7 d后的神經干細胞進行免疫熒光染色，鑒定神經元及神經膠質細胞，結果見圖1B、1C，MAP-2及GFAP 均陽性表達，進一步證明體外分離細胞為神經干細胞。

2.2H2O2對NSCs細胞凋亡的影響用不同濃度的H2O2(50、100、200 μmol/L)分別處理NSCs 2 h。通過流式細胞儀測定凋亡率。結果顯示凋亡率隨著H2O2濃度的增加而增加(圖2)。選用100 mol/L H2O2處理組，檢測蛋白質的表達。Western blot結果顯示，與對照組相比，Notch1(t=13.508，P<0.01)，Hes1(t=15.150，P<0.01)，Caspase-3(t=23.800，P<0.01)，Caspase-9(t=19.682，P<0.01)和Bax(t=14.002，P<0.01)蛋白的表達明顯升高，而Bcl-2(t=33.389，P<0.01)的表達則明顯低于對照組(圖3)。

2.3DAPT可保護神經干細胞免受H2O2誘導的細胞凋亡為了研究Notch1信號通路在H2O2誘導的氧化應激中的作用，將不同濃度的DAPT(5、10、20 μmol/L)加入到用H2O2處理的NSCs(2 h、100 μmol/L)中。通過流式細胞術測量細胞活力。隨著DAPT濃度的增加，細胞存活率顯著增加。實驗數(shù)據(jù)分析結果見圖4。通過Western blot檢測H2O2+ DAPT(10 μmol/L)組蛋白的表達。結果表明與100 μmol/L H2O2組比較，Notch1(t=9.470,P<0.01)，Hes1(t=8.728，P<0.01)， Caspase-3(t=10.035，P<0.01)， Bax(t=8.386，P<0.01)和Caspase-9(t=15.062，P<0.01)蛋白明顯降低;而Bcl-2(t=3.375，P<0.05)的表達顯著增加(圖5)。

2.4BMSC-CM保護神經干細胞免受H2O2誘導的細胞凋亡為了研究BMSC-CM在H2O2誘導的NSCs氧化應激中的保護作用，將不同濃度的BMSC-CM加入到H2O2處理過得的神經干細胞中(100 μmol/L，2 h)。通過流式細胞術測量細胞凋亡率。當BMSC-CM的濃度增加時，細胞存活率顯著增加。實驗數(shù)據(jù)分析結果見圖6。另外，Western blot檢測100 μmol/L H2O2+100 μmol/L BMSC-CM組蛋白的表達。與100 μmol/L H2O2處理組比較，Notch1(t=9.920,P<0.01)，Hes1(t=10.250，P<0.01)，Caspase-3(t=10.996，P<0.01)，Bax(t=10.136，P<0.01)和Caspase-9(t=10.824，P<0.01)明顯降低，而Bcl-2(t=4.353，P<0.05)的表達則顯著增加(圖7)。

圖1 神經干細胞免疫熒光染色結果 ×400

圖2不同濃度的過氧化氫對神經干細胞存活率的影響

A:對照組;B:50 μmol/L H2O2處理組;C:100 μmol/L H2O2處理組; D:200 μmol/L H2O2處理組;與對照組比較：**P<0.01;與50 μmol/L H2O2組比較：##P<0.01;與100 μmol/L H2O2組比較：$$P<0.01

圖3 加入H2O2后NSCs相關蛋白表達量比較

A：對照組;B：100 μmol/L H2O2處理組;與對照組比較:**P<0.01

圖4 向100 μmol/L H2O2中加入不同濃度的Notch通道阻滯劑(DAPT)后對神經干細胞存活率的影響

A:對照組; B: 100 μmol/L H2O2處理組; C: 100 μmol/L H2O2+5 μmol/L DAPT處理組; D: 100 μmol/L H2O2+10 μmol/L DAPT處理組;E: 100 μmol/L H2O2+20 μmol/L DAPT處理組;與對照組比較：**P<0.01;與100 μmol/L H2O2組比較：##P<0.01;與100 μmol/L H2O2+5 μmol/L DAPT組比較：$$P<0.01;與100 μmol/L H2O2+10 μmol/L DAPT組比較：&&P<0.01

圖5 加入DAPT后受損NSCs相關蛋白表達量比較

A：100 μmol/L H2O2處理組；B: 100 μmol/L H2O2+10 μmol/L DAPT處理組；與100 μmol/L H2O2處理組比較：#P<0.05,##P<0.01

圖6 向100 μmol/L H2O2中加入不同濃度的BMSC-CM后對神經干細胞存活率的影響

A:對照組; B: 100 μmol/L H2O2處理組; C: 100 μmol/L H2O2+50 μmol/L BMSC-CM處理組; D: 100 μmol/L H2O2+100 μmol/L BMSC-CM處理組; E: 100 μmol/L H2O2+200 μmol/L BMSC-CM處理組;與對照組比較：**P<0.01;與100 μmol/L H2O2組比較：##P<0.01;與100 μmol/L H2O2+50 μmol/L BMSC-CM組比較：$$P<0.01;與100 μmol/L H2O2+100 μmol/L BMSC-CM組比較：&&P<0.01

圖7 加入BMSC-CM后受損NSCs相關蛋白表達量比較

A：100 μmol/L H2O2處理組；B: 100 μmol/L H2O2+100 μmol/L BMSC-CM處理組；與100 μmol/L H2O2處理組比較：$P<0.05,$$P<0.01

3 討論

本研究結果表明BMSC-CM可以減少用H2O2處理的NSCs的凋亡。此外，當把BMSC-CM加入到H2O2誘導的神經干細胞時，Notch1和Hes1的表達降低。這些結果表明，BMSC-CM可能是通過抑制Notch1信號通路減弱氧化應激損傷從而產生對NSCs的保護作用。

脊髓損傷后的氧化應激環(huán)境是影響干細胞移植治療的關鍵因素。最近的一項研究[8]表明，H2O2可模擬氧化應激環(huán)境，誘導細胞功能障礙和細胞凋亡。在本研究中，在H2O2的幫助下，模擬了NSCs培養(yǎng)過程中的氧化應激環(huán)境。結果表明，當向神經干細胞中加入H2O2后，細胞凋亡率隨之增加。這與Wang et al[8]的研究是相一致的。

Boopathy et al[9]之前已經研究發(fā)現(xiàn)，當細胞暴露于H2O2時，Notch1信號通路可以被激活。當Notch1信號通路被激活時，細胞膜上的Notch1受體與其相鄰的配體(Delta和Jagged)組合。隨后，腫瘤壞死因子α轉換酶(TACE-α)和早老素1(2)(PS1 / 2)參與酶過程，切除大部分Notch1受體的細胞外結構域，然后釋放Notch1細胞內結構域(NICD)進入細胞質。在NICD進入細胞質后，其進一步轉移到細胞核中，其結合DNA結合蛋白CBF / RBP-JK以形成轉錄激活物并激活其相關的下游基因。在哺乳動物中，Notch的主要下游靶基因是HES(分裂的毛發(fā)/增強子)和ESR基因家族中的基因，如Hes-1和Hes-5[10]。在本文中，通過Western blot蛋白檢測結果顯示，當加入H2O2后Notch1和Hes1的表達會增加，這與之前研究[11-12]結果相一致。為了進一步研究Notch1信號通路對H2O2誘導的NSCs細胞凋亡的影響，使用DAPT用于特異性阻斷Notch1信號通路。結果顯示當DAPT加入后細胞存活率顯著提高，而且細胞的凋亡率與DAPT的濃度呈負相關性。

近幾年研究[13]顯示BMSC-CM具有神經保護作用，因此BMSC-CM被認為是神經損傷疾病中的潛在治療劑。然而，神經干細胞中BMSC-CM的具體機制尚未公開。本研究設計了一個實驗組，通過向H2O2誘導后的神經干細胞加入BMSC-CM來驗證條件培養(yǎng)基的保護作用。結果顯示加入BMSC-CM處理后的實驗組，細胞存活率明顯增強。為了進一步研究BMSC-CM與Notch1信號通路的關系，采用Western blot法檢測Notch1和Hes1的表達。結果表明加入BMSC-CM實驗組，Notch1和Hes1表達量顯著降低。結合以上的實驗結果表明，Notch1信號通路是調節(jié)神經干細胞凋亡的重要通路，且條件培養(yǎng)基可以通過抑制Notch1信號通路提高神經干細胞的存活率。

研究[14]證明，Bax、Bcl-2和Caspase-3家族在調節(jié)細胞凋亡中起關鍵作用，是細胞存活途徑的重要成員，當Caspase-3被激活后，可以激活更多的下游凋亡因子，如Caspase-6和Caspase-9，這將進一步增強對細胞的凋亡作用。 Bcl-2可以抑制多種細胞毒性因子提高細胞存活率。 Bcl-2的過度表達可以減少氧自由基的產生和脂質過氧化物的形成。 因此目前有學者認為Bcl-2的表達強弱可以作為細胞對細胞毒素的抵抗力的觀察指標[15]，表明Bcl-2是凋亡過程執(zhí)行步驟的重要組成部分。在本研究中，BMSC-CM和DAPT可以抑制Caspase-3、Caspase-9、Bax的表達，并增強Bcl-2的表達。這些結果表明Notch1途徑可能與Bax、Bcl-2和Caspase家族相關，BMSC-CM通過參與調節(jié)神經干細胞中Bcl-2表達和Caspase家族來減弱細胞凋亡。

[1] Bergstr M T. Neural stem cells: brain building blocks and beyond[J]. Ups J Med Sci,2012,117(2):132-42.

[2] Badner A, Siddiqui A M,Fehlings M G. Spinal cord injuries: how could cell therapy help[J]. Expert Opin Biol Ther,2017,17(5):529-41.

[3] Sohn H M, Hwang J Y, Ryu J H, et al. Simvastatin protects ischemic spinal cord injury from cell death and cytotoxicity through decreasing oxidative stress:invitroprimary cultured rat spinal cord model under oxygen and glucose deprivation-reoxygenation conditions[J]. J Orthop Surg Res, 2017, 12(1):36.

[4] Roshanzamir F. Quercetin attenuates cell apoptosis of oxidant-stressed SK-N-MC cells while suppressing up-regulation of the defensive element, HIF-1α[J]. Neuroscience, 2014, 277:780-93.

[5] Chen S D, Yin J H, Hwang C S, et al. Anti-apoptotic and anti-oxidative mechanisms of minocycline against sphingomyelinase/ceramide neurotoxicity: implication in Alzheimer's disease and cerebral ischemia[J]. Free Radic Res,2012,46(8):940-50.

[6] Shi Y, Hu Y, Lv C. Effects of reactive oxygen species on differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Ann Transplant, 2016, 21:695-700.

[7] 李海太, 申才良, 宋旆文,等. BMP-4對大鼠骨髓間充質干細胞與神經干細胞共培養(yǎng)轉歸影響的實驗研究[J]. 安徽醫(yī)科大學學報, 2016, 51(2):205-9.

[8] Wang S, Zhang T, Yang Z, et al. Heme oxygenase-1 protects spinal cord neurons from hydrogen peroxide-induced apoptosisviasuppression of Cdc42/MLK3/MKK7/JNK3 signaling[J]. Apoptosis, 2017, 22(3):449-62.

[9] Boopathy A V, Pendergrass K D, Che P L, et al. Oxidative stress-induced Notch1 signaling promotes cardiogenic gene expression in mesenchymal stem cells[J]. Stem Cell Res Ther,2013,4(2):43.

[10] Deskin B, Lasky J, Zhuang Y. Requirement of HDAC6 for activation of Notch1 by TGF-β1[J]. Sci Rep,2016,6:31086.

[11] Tang G, Liu Y, Zhang Z, et al. Mesenchymal stem cells maintain blood-brain barrier integrity by inhibiting aquaporin-4 upregulation after cerebral ischemia[J]. Stem Cells , 2014, 32(12):3150-62.

[12] Kamarehei M. Modulation of notch signaling pathway to prevent H2O2/menadione-induced SK-N-MC cells death by EUK134 [J]. Cell Mol Neurobiol, 2014, 34(7): 1037-45.

[13] Cui C, Cui Y, Gao J, et al. Intraparenchymal treatment with bone marrow mesenchymal stem cell-conditioned medium exerts neuroprotection following intracerebral hemorrhage[J]. Mol Med Rep, 2017, 15(4):2374-82.

[14] Hsieh M J, Lin C W, Chen M K, et al. Inhibition of cathepsin S confers sensitivity to methyl protodioscin in oral cancer cellsviaactivation of p38 MAPK/JNK signaling pathways[J]. Sci Rep, 2017, 7:45039.

[15] Ding Y, Tian Y, Zeng Z, et al. YCl3 promotes neuronal cell death by inducing apoptotic pathways in rats[J]. Biomed Res Int, 2017, 2017:2183658.