程 攀，何 慶，張曉宇，張永學(xué)，張文欣，汪志偉，趙慶中，高 杉

尼古丁(nicotine)是一種無色的液態(tài)生物堿，最早從煙草中提取發(fā)現(xiàn)，故又名煙堿。煙堿性劇毒，小劑量可興奮呼吸中樞，升高血壓，而大劑量攝入將引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的麻痹。研究[1]顯示尼古丁在循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等中存在負(fù)性效應(yīng)，其中對(duì)心血管功能的影響極為重要，通過損傷血管內(nèi)皮，影響血脂代謝，誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。同時(shí)尼古丁誘導(dǎo)細(xì)胞膜的損傷，干擾GSH代謝循環(huán)，影響氧化-抗氧化平衡[2]。目前，在尼古丁染毒動(dòng)物模型的建立、尼古丁生物學(xué)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)室研究中，多采用皮下注射方法；在研究煙草危害的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，多采用香煙燃燒、電子煙煙霧暴露法。但皮下注射法對(duì)于模擬吸煙環(huán)境的真實(shí)性很差，直接燃燒香煙法對(duì)于環(huán)境存在污染，而使用電子煙暴露法除環(huán)境污染外，成本也太高。為此，該實(shí)驗(yàn)建立了載氣吹掃尼古丁吸入暴露法觀察和研究尼古丁吸入暴露對(duì)大鼠心血管功能、氧化應(yīng)激狀態(tài)和炎癥水平的影響。

1 材料與方法

1.1藥物及儀器尼古丁；一氧化氮(nitric oxide, NO)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)試劑盒、PE聚乙烯塑料管、靜脈穿刺套管針、氣相色譜儀、BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

1.2載氣吹掃尼古丁吸入暴露法建立該實(shí)驗(yàn)結(jié)合氣象色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS)定性、定量分析技術(shù)，建立了載氣吹掃尼古丁吸入暴露法，該方法采用空氣氣流、氧濃度穩(wěn)定，尼古丁濃度恒定可控。本研究根據(jù)GC-MS結(jié)果，確定尼古丁吸入濃度為5.083 μg/ml，擬在該濃度下進(jìn)行大鼠吸入暴露實(shí)驗(yàn)。

1.3動(dòng)物模型制備及分組40只雄性SD大鼠，體重(180±10)g。隨機(jī)均分為對(duì)照組、尼古丁低劑量組、尼古丁中劑量組和尼古丁高劑量組，每組10只。其中每天固定時(shí)間，低、中、高劑量尼古丁組分別暴露處理1、2、4 h，連續(xù)90 d。除煙霧暴露外，各組動(dòng)物其他飼養(yǎng)條件相同。

1.4測(cè)量指標(biāo)

1.4.1尾動(dòng)脈無創(chuàng)測(cè)壓 打開儀器預(yù)熱、定標(biāo)后，固定大鼠，將加壓套固定至大鼠近尾根部。使鼠尾穿過脈搏傳感器，插入尾部加熱器中的加熱管內(nèi)，保持鼠尾正好處于脈搏傳感器的“脈搏信號(hào)傳感片”上方。調(diào)節(jié)鼠尾壓迫片至傳感片緊貼鼠尾下方的尾動(dòng)脈，待大鼠脈搏穩(wěn)定，開始測(cè)量血壓。

1.4.2頸動(dòng)脈插管 麻醉后，手術(shù)暴露右頸總動(dòng)脈5～8 mm，游離的動(dòng)脈兩端用動(dòng)脈夾固定。將套管穿刺針沿動(dòng)脈走行刺入，拔出穿刺針，將動(dòng)脈近心端動(dòng)脈夾取下，僅留套管于動(dòng)脈。手持針柄將套管小心送入心臟方向，至顯示壓力波形為左心室壓力為止。

1.4.3體外血管環(huán) 設(shè)定水浴鍋溫度為37 ℃，調(diào)至“液溫”檔。打開BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，定標(biāo)、定張力、定零值。處死大鼠后，迅速取出胸主動(dòng)脈，置于持續(xù)通有95% O2+5% CO2混合氣體的Krebs液中。于解剖顯微鏡下，用眼科剪剔除多余的結(jié)締組織和脂肪組織，沖凈血管內(nèi)余血，剪成4～5 mm的血管環(huán)后，小心穿至張力傳感器的三角環(huán)上。倒入10 ml Krebs液于浴槽并持續(xù)通混合氧，給予靜息張力0.5 g，孵育1 h，每15 min換液1次。放液，加入10 ml高K+溶液進(jìn)行血管預(yù)收縮刺激，13 min待穩(wěn)定后Krebs液洗掉高鉀溶液，每10 min換一次液。加入10 ml Krebs液接著加10 μl PE(10 mmol/L)，計(jì)時(shí)13 min。穩(wěn)定后，由低到高依次加入濃度為0.01、0.1、1、10 mmol/L的Ach溶液，觀察濃度梯度下血管內(nèi)皮依賴的舒張活性。

1.4.4血清NO、MDA、GSH-Px的含量和SOD活性含量測(cè)定 麻醉后，行頸總動(dòng)脈取血，于4 ℃下離心15 min(1 500 r/min)分離血清，然后按試劑盒說明測(cè)定血清中NO含量、MDA、GSH-Px的含量和SOD活性檢測(cè)。

1.4.5ELISA檢測(cè) 嚴(yán)格按試劑盒，用ELISA檢測(cè)血清、心肌組織和肺組織中白介素1β(interleukin-1β, IL-1β)、白介素10(interleukin-10, IL-10)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial NO synthase, eNOS)水平。

2 結(jié)果

2.1長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠心重指數(shù)、肺重指數(shù)和腎重指數(shù)的影響SD大鼠長期吸入尼古丁后，與對(duì)照組比較，尼古丁低、中、高劑量組體重和心重有降低趨勢(shì)，其中尼古丁中劑量組體重和心重降低明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。尼古丁低劑量組心重指數(shù)(HW/BW)及尼古丁高劑量組肺重指數(shù)(LW/BW)和腎重指數(shù)(KW/BW)降低明顯。見表1。

2.2長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠尾動(dòng)脈壓的影響與對(duì)照組比較，尼古丁低、中、高劑量組動(dòng)脈血壓都有明顯的不同程度的上升趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

表1 長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠心重指數(shù)、肺重指數(shù)和腎重指數(shù)的影響

與對(duì)照組比較：**P<0.01

表2 長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠心功能的影響

HR：心率；LVSP：左心室收縮壓；LVEDP：左心室終末舒張壓；+dp/dtmax：左心室內(nèi)壓最大上升速率；-dp/dtmax：左心室內(nèi)壓最大下降速率；ABP：頸動(dòng)脈壓；與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖1 長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠尾動(dòng)脈壓的影響

2.3長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠心功能的影響SD大鼠長期吸入尼古丁后，與對(duì)照組比較，尼古丁高劑量組左心室收縮壓與舒張壓明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，尼古丁低、中、高劑量組動(dòng)脈血壓發(fā)生不同程度的增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

2.4長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠血管舒張功能的影響與對(duì)照組比較，尼古丁高劑量組對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)有明顯的下降趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.5長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠血清NO含量及心、肺、血清e(cuò)NOS表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，尼古丁低、中、高劑量組血清NO有不同程度的下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見圖3。心、肺、血清e(cuò)NOS含量均有明顯的降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

圖2 長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠血管舒張功能的影響

圖3 長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠血清NO含量的影響

1：對(duì)照組；2：尼古丁低劑量組；3：尼古丁中劑量組；4：尼古丁高劑量組；與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖4 長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠心、肺、血清e(cuò)NOS表達(dá)的影響

A：心肌組織中eNOS蛋白表達(dá)；B：肺組織中eNOS蛋白表達(dá)；C：血清中eNOS蛋白表達(dá)；1：對(duì)照組；2：尼古丁低劑量組；3：尼古丁中劑量組；4：尼古丁高劑量組；與對(duì)照組比較：**P<0.01

2.6長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠血清MDA、GSH-Px含量及SOD活性的影響與對(duì)照組比較，尼古丁低、中、高劑量組血清MDA含量明顯降低，GSH-Px含量明顯升高，SOD活性增加。其中，尼古丁低劑量和中劑量組MDA含量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；尼古丁低、中劑量組GSH-Px有不同程度的增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；尼古丁低劑量組SOD活性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

2.7長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10含量的影響SD大鼠長期吸入尼古丁后，與對(duì)照組比較，尼古丁低、中劑量組血清中TNF-α量顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。尼古丁低、中、高劑量組血清中IL-1β量幾乎無變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組比較，尼古丁低劑量和中劑量組血清IL-10量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖6。

圖5 長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠血清MDA、GSH-Px含量及SOD活性的影響

A：MDA；B：GSH-Px；C：SOD活性；1：對(duì)照組；2：尼古丁低劑量組；3：尼古丁中劑量組；4：尼古丁高劑量組；與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖6 長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠血清TNF-α、IL-1β、

A：TNF-α；B：IL-1β；C：IL-10；1：對(duì)照組；2：尼古丁低劑量組；3：尼古丁中劑量組；4：尼古丁高劑量組；與對(duì)照組比較：**P<0.01

2.8長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠肺TNF-α、IL-1β、IL-10含量的影響SD大鼠長期吸入尼古丁后，與對(duì)照組比較，尼古丁低、中、高劑量組肺組織TNF-α、IL-1β、IL-10 含量都有不同程度的增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖7。

2.9長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠心肌TNF-α、IL-1β、IL-10含量的影響SD大鼠長期吸入尼古丁后，與對(duì)照組比較，尼古丁低、中、高劑量組心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-10含量有不同程度的增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖8。

3 討論

圖7 長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-10含量的影響

A：TNF-α；B：IL-1β；C：IL-10；1：對(duì)照組；2：尼古丁低劑量組；3：尼古丁中劑量組；4：尼古丁高劑量組；與對(duì)照組比較：**P<0.01

煙草中含有多種生物活性物質(zhì)，其中最重要的活性成分是尼古丁，而尼古丁是引起肺部疾病，心血管疾病和免疫功能障礙發(fā)展中的主要危險(xiǎn)因素[3]。氧自由基的產(chǎn)生可抑制eNOS的活性，進(jìn)而影響NO和內(nèi)皮素1(endothelin-1, ET-1)的釋放[4]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是一層覆蓋在血管管腔的單層細(xì)胞，已證實(shí)內(nèi)皮具有活躍的內(nèi)分泌功能，通過釋放多種介質(zhì)，參與血管的收縮與舒張，血管的生成以及炎癥反應(yīng)[5]。各種物理化學(xué)因素、氧化應(yīng)激、炎癥等都可造成血管內(nèi)皮的損傷，而內(nèi)皮損傷是高血壓、冠心病等疾病發(fā)展的重要病理學(xué)基礎(chǔ)。尼古丁通過改變NO緩激肽，內(nèi)皮素和白三烯的釋放來影響血管張力，其中NO是血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌最重要的血管舒張因子，作為反映血管受損程度及功能的一項(xiàng)指標(biāo)，在調(diào)控血管張力中有著重要意義。血管內(nèi)皮細(xì)胞通過eNOS生成NO，eNOS是誘導(dǎo)合成NO的關(guān)鍵性限速酶，eNOS/NO信號(hào)通路與高血壓等內(nèi)皮功能障礙相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

圖8 長期吸入尼古丁對(duì)SD大鼠心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-10含量的影響

A：TNF-α；B：IL-1β；C：IL-10；1：對(duì)照組；2：尼古丁低劑量組；3：尼古丁中劑量組；4：尼古丁高劑量組；與對(duì)照組比較：**P<0.01

活性氧(reactive oxygen species，ROS)引起細(xì)胞的毒性過程稱為氧化應(yīng)激，在調(diào)控血管張力和內(nèi)皮功能中有著重要意義。尼古丁可增加血液ROS 的產(chǎn)生，且存在劑量依賴性[6]。其中，過氧化的脂質(zhì)可分解產(chǎn)生MDA，因此MDA的含量可作為一項(xiàng)細(xì)胞受損程度和自由基產(chǎn)生情況的指標(biāo)。而GSH-Px和SOD在吸煙介導(dǎo)的氧化應(yīng)激中都有著重要的保護(hù)作用，兩者可以用來評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的影響程度[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠血清SOD活性升高，GSH-Px含量增加，而MDA含量明顯降低，其機(jī)制可能與尼古丁通過作用于煙堿型乙酰膽堿受體，同時(shí)激動(dòng)交感神經(jīng)系統(tǒng)和副交感神經(jīng)系統(tǒng)，引起的機(jī)體氧化-抗氧化水平的失衡有關(guān)。

TNF-α作為機(jī)體創(chuàng)傷或感染后產(chǎn)生最早的炎性因子之一，TNF-α的水平是反映肺部感染及病變程度的良好指標(biāo)。而IL-1β與TNF-α有十分相似的作用，在肺部炎性疾病早期，IL-1β參與肺部炎性疾病的發(fā)病過程，在急性肺損傷中，IL-1β較早生成，可誘發(fā)、放大炎癥反應(yīng)，臨床上以其水平的高低來判斷肺損傷程度[8-12]。同時(shí)IL-1β也會(huì)導(dǎo)致肺纖維化，主要誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，可通過協(xié)同TNF-α并促進(jìn)其他炎性因子的表達(dá)，進(jìn)而加強(qiáng)炎性反應(yīng)程度[13]。IL-10是由Th2 細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，是強(qiáng)有力的抗炎因子。尼古丁抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β和IL-12的產(chǎn)生，同時(shí)刺激IL-10的分泌，通過作用于煙堿受體發(fā)揮抗炎作用[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，尼古丁低、中、高劑量組的心、肺組織TNF-α、IL-1β、IL-10含量均明顯升高，說明尼古丁的吸入可引起大鼠心、肺組織的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用載氣吹掃尼古丁吸入法，觀察到尼古丁可引起大鼠內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和血壓的升高，氧化應(yīng)激的失衡和心、肺組織的炎癥及心功能的損傷，其深入機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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