李曉鳳，王 媛，李 磊，許 奇，張 瑾，王烈成

晝夜節(jié)律是以24 h左右為周期的規(guī)律性變化，影響晝夜節(jié)律的因素包括光照、聲音、飲食、運(yùn)動(dòng)和激素等，其中光照在睡眠-覺(jué)醒的調(diào)控起重要作用[1]。眼睛接收和處理周圍環(huán)境中的光信號(hào)并傳至大腦，通過(guò)睡眠-覺(jué)醒中樞的分析綜合，進(jìn)而調(diào)控睡眠和覺(jué)醒[2]。脆性X智力低下基因(Fragile X mental retardation 1，F(xiàn)mr1)的功能及相關(guān)疾病的研究起始于上世紀(jì)九十年代[3]。Fmr1在基因組中跨越38 000 bp，由17個(gè)外顯子和16個(gè)內(nèi)含子組成[4]，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA編碼由596個(gè)氨基酸殘基組成的脆性X智力低下蛋白(Fragile X mental retardation protein，F(xiàn)mrp)[5]，參與調(diào)解中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)850多種mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯[6-7]。Fmr1基因缺失或沉默，導(dǎo)致Fmrp蛋白合成和分泌不足，從而引起神經(jīng)元結(jié)構(gòu)異常和功能紊亂。研究[8]表明，脆性X綜合征(Fragile X syndrome, FXS)在行為、認(rèn)知和情感等方面存在異常。該研究通過(guò)改變光信號(hào)分析Fmr1 KO小鼠和WT小鼠的睡眠-覺(jué)醒變化，旨在為Fmr1 KO小鼠的研究提供參考，為治療Fmr1相關(guān)的自閉癥提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Fmr1 KO 10周齡雄性C57BL/6J小鼠(n=11)，20～25 g(北京大學(xué)生命科學(xué)院生物膜與膜生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室張晨研究員友情提供)；SPF級(jí)10周齡雄性C57BL/6J小鼠(n=13)，20～25 g(安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。實(shí)驗(yàn)小鼠置于獨(dú)立通風(fēng)籠內(nèi)飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。光照時(shí)間8:00 am～8:00 pm，溫度22～24 ℃，濕度55%～60%。

1.1.2主要試劑與儀器 小鼠適配器、高速顱骨鉆(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；造牙粉、義齒基托樹(shù)脂(上海二醫(yī)張江生物材料有限公司)；記錄排線(東莞市耀博電子有限公司)；組織膠(日本Toagosei公司)；MP150多導(dǎo)生理信號(hào)記錄分析系統(tǒng)(美國(guó)Biopac公司)；Sleepsign睡眠分析軟件(日本Kissei Comtec株式會(huì)社)；PCR儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1基因鑒定 小鼠出生后2周，取尾部組織50 mg左右于EP管中，剪碎并做好標(biāo)記。加入80 μl NaOH(50 mmol/L)，放入99 ℃金屬浴中30 min，加入40 μl Tris-Hcl(1 mmol/L)?；靹蚝笕「? μl樣品加入反應(yīng)體系(ddH2O+Buffer+dNTP+TAP酶+引物)，混勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)(94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃ 10 min)。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物2 μl進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，與Marker作比較，條帶約500 bp為WT小鼠，條帶約800 bp為Fmr1 KO小鼠。選出需要的基因型雄鼠進(jìn)行單獨(dú)飼養(yǎng)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 WT and Fmr1 KO 小鼠的PCR驗(yàn)證引物

1.2.2動(dòng)物手術(shù)

1.2.2.1 小鼠麻醉和固定 采用4%戊巴比妥鈉對(duì)小鼠行腹腔麻醉，麻醉劑量為0.04 ml/g。待小鼠痛覺(jué)反射消失后，將其固定于小鼠腦立體定位適配器上。

1.2.2.2 顱骨暴露和埋置腦電電極 剪去小鼠頭頂毛發(fā)，并用75%酒精消毒皮膚，沿露骨正中線切開(kāi)皮膚，分離皮下組織使顱骨充分暴露。分別于冠狀縫前1.0 mm及人字縫前1.0 mm與顱骨中線兩側(cè)旁開(kāi)1.5 mm處用顱骨鉆鉆通顱骨(注意不要弄破硬腦膜)，先后用組織膠和牙科水泥將腦電電極固定于顱骨上，腦電電極下端觸碰硬腦膜為度，用于記錄皮層腦電活動(dòng)。

1.2.2.3 固定肌電電極并縫合傷口 將兩根肌電電極分別插入小鼠頸背部?jī)蓚?cè)的斜方肌內(nèi)，用于記錄肌電活動(dòng)。然后將電極底座用組織膠和牙科水泥于顱骨上。傷口處給予青霉素粉末并縫合傷口。將小鼠側(cè)臥位放于預(yù)先加熱好的電熱毯上，待小鼠恢復(fù)清醒后放入恒溫、恒濕、隔音和靜電屏蔽功能的屏蔽箱內(nèi)單獨(dú)飼養(yǎng)，屏蔽箱內(nèi)正常光照時(shí)間設(shè)置為：8:00 am～8:00 pm。

1.2.2.4 連線適應(yīng) 術(shù)后1周，將記錄腦電和肌電的排線與小鼠頭部的電極連接適應(yīng)5 d，屏蔽箱內(nèi)光照8:00 am ～ 8:00 pm。

1.2.3記錄方法 為了盡可能減小對(duì)小鼠睡眠-覺(jué)醒周期的影響，適應(yīng)結(jié)束后采取連續(xù)記錄的方式。記錄12 h : 12 h明暗條件下的睡眠-覺(jué)醒情況；記錄9:00 am ～ 11:00 am關(guān)燈2 h條件的睡眠-覺(jué)醒情況。小鼠的睡眠-覺(jué)醒情況包括：覺(jué)醒(wake，W)、慢波睡眠(slow wave sleep，SWS)和快波睡眠(fast wave sleep，F(xiàn)WS)。

2 結(jié)果

2.1小鼠基因鑒定結(jié)果手術(shù)前，采用PCR技術(shù)鑒定Fmr1 KO和WT小鼠，選取Fmr1 KO純合子(-/-)和WT純合子(+/+)，PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。Fmr1 KO純合子小鼠擴(kuò)增出約400 bp的DNA片段，WT純合子小鼠擴(kuò)增出約131 bp的DNA片段。經(jīng)過(guò)PCR技術(shù)鑒定，確保了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品種正確。

圖1 小鼠基因型鑒定結(jié)果

M：Marker；1、2、5、6、9、10、11：WT(+/+)；4、8、12：KO(-/-)；3、7：KO(+/-)

2.2正常光照條件下WT和Fmr1KO小鼠的睡眠-覺(jué)醒成一致的晝夜節(jié)律現(xiàn)象12 h ∶12 h明暗(8:00 am開(kāi)燈和8:00 pm關(guān)燈)交替中的光授時(shí)信號(hào)對(duì)Fmr1 KO(n=4)和WT小鼠(n=6)的總睡眠時(shí)間(total sleep time，TST)和覺(jué)醒時(shí)間的影響具有一致的晝夜節(jié)律變化，二者之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

2.3光授時(shí)信號(hào)對(duì)WT和Fmr1KO小鼠在9:00am～11:00am期間覺(jué)醒量的影響與正常12 h ∶12 h明暗(8:00 am開(kāi)燈和8:00 pm關(guān)燈)交替的時(shí)段相比，WT小鼠(n=6)在關(guān)燈2 h(9:00 am～11:00 am)時(shí)的覺(jué)醒量發(fā)生明顯變化，尤其是在關(guān)燈后的第1小時(shí)覺(jué)醒量顯著增加(P<0.01)。具體表現(xiàn)為：關(guān)燈后的第一個(gè)階段(9:00 am～9:20 am)小鼠的覺(jué)醒量由(17.66±4.92)%增長(zhǎng)至(85.86±8.78)%(t=-11.60，P<0.01)，第二個(gè)階段(9:20 am～9:40 am)由(10.21±4.21)%增長(zhǎng)至(61.53±7.93)%(t=-14.01，P<0.01)，第三個(gè)階段(9:40 am～10:00 am)由(35.92±8.27)%增長(zhǎng)至(63.62±9.46)%(t=-5.40，P<0.01)。見(jiàn)圖3B。

圖2 WT和Fmr1 KO小鼠在12 L/12 D條件下的總睡眠時(shí)間和覺(jué)醒時(shí)間的分布

圖3 Fmr1 KO和WT小鼠在9:00 am～11:00 am關(guān)燈前后覺(jué)醒情況分布圖

相比于WT小鼠相同時(shí)間段關(guān)燈前后的變化，F(xiàn)mr1 KO小鼠(n=6)覺(jué)醒量的增加幅度顯著降低(P<0.01)。具體表現(xiàn)為：關(guān)燈后的第一個(gè)階段(9:00 am～9:20 am)小鼠的覺(jué)醒量由(21.39±8.90)%增長(zhǎng)至(37.91±11.11)%(t=-2.84，P<0.05)，關(guān)燈后的第二個(gè)階段(9:20 am ～ 9:40 am)由(16.20±8.63)%增長(zhǎng)至(49.41±17.15)%(t=-4.24，P<0.01)，關(guān)燈后的第三個(gè)階段(9:40 am～10:00 am)由(35.38±10.10)%增長(zhǎng)至(62.47±11.77)%(t=-4.28，P<0.01)。見(jiàn)圖3C。

2.4光授時(shí)信號(hào)對(duì)WT和Fmr1KO小鼠在9:00am～11:00am期間時(shí)相轉(zhuǎn)換的影響與正常光照(8:00 am開(kāi)燈和8:00 pm關(guān)燈)的相同時(shí)段相比，WT和Fmr1 KO小鼠關(guān)燈2 h期間(9:00 am～11:00 am)的SWS、FWS和W時(shí)相的轉(zhuǎn)換數(shù)也發(fā)生明顯的變化(P<0.05)。

圖4 WT和Fmr1 KO小鼠9:00 am～11:00 am關(guān)燈期間的時(shí)相轉(zhuǎn)換數(shù)

A、 B、C：9:00 am～10:00 am；D、E、F：10:00 am～11:00 am；其中A、D：SWS-W、B、E：W-SWS；C、F：FWS-W；與正常光照比較：*P<0.05,**P<0.01

9:00 am～10:00 am關(guān)燈期間WT小鼠的SWS-W、W-SWS和FWS-W時(shí)相的轉(zhuǎn)換數(shù)依次由(5.14±0.51)增加至(28.86±1.77)(t=-12.91，P<0.01)、(6.00±0.31)增加至(32.86±1.65)(t=-15.97，P<0.01)和(0.86±0.26)增加至(4.00±0.44)(t=-6.18，P<0.01)；與自身正常光照相同時(shí)段相比，10:00 am～11:00 am關(guān)燈期間WT小鼠的SWS-W、W-SWS和FWS-W時(shí)相的轉(zhuǎn)換數(shù)的變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

9:00 am～10:00 am關(guān)燈期間Fmr1 KO小鼠的SWS-W、W-SWS和FWS-W時(shí)相的轉(zhuǎn)換數(shù)依次由(5.29±0.36)增加至(15.71±0.57)(t=-15.56，P<0.01)、(6.29±0.42)增加至(24.71±0.68)(t=-23.05，P<0.01)和(1.00±0.31)增加至(9.43±0.48)(t=-14.75，P<0.01)；與自身正常光照相同時(shí)段相比，10:00 am～11:00 am關(guān)燈期間Fmr1 KO小鼠的SWS-W、W-SWS和FWS-W時(shí)相轉(zhuǎn)換數(shù)的變化較前一個(gè)小時(shí)明顯減弱，但差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

3 討論

本試驗(yàn)是在基因鑒定的基礎(chǔ)上，選用Fmr1 KO純合子雄性小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，以光授時(shí)信號(hào)為試驗(yàn)因子，探究Fmr1 KO小鼠在睡眠-覺(jué)醒方面存在的異常。在本研究中，正常光照條件下Fmr1 KO小鼠和WT小鼠的睡眠-覺(jué)醒都具有一致的晝夜節(jié)律現(xiàn)象；改變9:00 am～11:00 am期間的光授時(shí)條件，F(xiàn)mr1 KO在覺(jué)醒量和睡眠-覺(jué)醒時(shí)相轉(zhuǎn)換數(shù)方面與WT小鼠存在差異，由此推測(cè)與WT小鼠相比較，F(xiàn)mr1 KO小鼠受光授時(shí)信號(hào)的影響有所減弱。而說(shuō)明光信號(hào)如何通過(guò)視網(wǎng)膜上的感光細(xì)胞對(duì)Fmr1 KO小鼠的睡眠-覺(jué)醒產(chǎn)生影響，將有助于為患有與Fmr1基因有關(guān)的自閉癥人群改善睡眠質(zhì)量提供理論指導(dǎo)。

需要注意的是，小鼠是夜行性動(dòng)物，而人類是晝行性動(dòng)物，因此試驗(yàn)中在白天改變光授時(shí)信號(hào)?；蚯贸姆椒ㄖ圃斓膭?dòng)物模型，與真正意義上的FXS在分子基礎(chǔ)上有著一定上的區(qū)別。最近研究[9]表明，新型轉(zhuǎn)基因小鼠有待進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)。另外，由于Fmr1基因位于X染色體上，而男性患者只有一條X染色體，當(dāng)Fmr1基因突變之后，不能像女性患者那樣有一個(gè)補(bǔ)償性的Fmr1基因，故男性FXS的智力和行為缺陷較女性患者更重一些，因此性別因素成為不可忽略的重要方面。故在本研究中選擇雄性Fmr1 KO小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

自閉癥的病因包括遺傳和非遺傳因素，F(xiàn)XS是遺傳因素中最常見(jiàn)的類型。關(guān)于自閉癥睡眠問(wèn)題的報(bào)道日益增多。目前以Fmr1 KO小鼠為模型動(dòng)物研究FXS睡眠問(wèn)題的報(bào)道較少，特別是通過(guò)埋置腦電和肌電電極全程監(jiān)測(cè)Fmr1 KO小鼠睡眠-覺(jué)醒情況的研究鮮有報(bào)道，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于實(shí)時(shí)監(jiān)控和精確統(tǒng)計(jì)。

光信號(hào)對(duì)Fmr1 KO小鼠的睡眠-覺(jué)醒具有調(diào)控作用，相比于WT小鼠，F(xiàn)mr1 KO小鼠的睡眠-覺(jué)醒受光信號(hào)改變的影響有所減弱。

[1] 朱大年, 王庭槐.生理學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社, 2013:356-7.

[2] Rusak B, Zucker I. Neural regulation of circadian rhythms[J]. Physiol Rev, 1979, 59(3): 449-526.

[3] Verheij C, Bakker C E, Graaff E, et al. Characterization and localization of the FMR-1 gene product associated with fragile X syndrome[J]. Nature, 1993, 363(6431): 722-4.

[4] Ashley C T, Wilkinson K D, Reines D, et al. FMR1 protein:conserved RNP family domains and selective RNA binding[J]. Science, 1993, 262(5133):563.

[5] Siomi H, Siomi M C, Nussbaum R L, et al. The protein product of the fragile X gene,FMR1,has characteristics of an RNA-binding protein[J].Cell,1993,74(2): 291-8.

[6] Ascano M J, Mukherjee N, Bandaru P, et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression[J]. Nature, 2012, 492(7429): 382-6.

[7] Monaghan K G, Lyon E, Spector E B. ACMG Standards and Guidelines for fragile X testing: a revision to the disease specific supplements to the standards and guidelines for clinical genetics laboratories of the American college of medical genetics and genomics[J]. Genet Med,2013, 15(7): 575-86.

[8] Fu Y H, Kuhl D P, Pizzuti A, et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox[J]. Cell, 1991, 67(6): 1047-58.

[9] Sellier C, Buijsen R A, He F, et al. Translation of expanded cgg repeats into fmrpolyg is pathogenic and may contribute to fragile x tremor ataxia syndrome[J]. Neuron, 2017, 93(2): 331-47.