劉富偉 胡奧 張浚睿 郝英 許珊珊 侯燕 靳丹 趙芝鶴 薄斌 孔亮

小耳畸形是僅次于唇腭裂之后最常見的口腔頜面部畸形，發(fā)病率為5.18/萬，同時(shí)也是最易導(dǎo)致患者面容不對稱的先天性畸形之一［1－2］。耳廓的支架構(gòu)成以軟骨為主，組織發(fā)育來源與顱面骨相似，其中軟骨細(xì)胞的增殖與分化對軟骨組織最終形態(tài)及功能發(fā)揮起重要作用［3］。酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(Casein kinase 2 interacting protein-1，Ckip-1)作為重要的骨負(fù)調(diào)控因子，研究證實(shí)應(yīng)用其siRNA可以促進(jìn)大鼠下頜骨牽張區(qū)骨形成以及種植體骨結(jié)合效果［4－5］，為其在頜面部應(yīng)用打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。課題組前期研究顯示Ckip-1對于頜骨和長骨呈現(xiàn)不同的影響效果［6］。然而Ckip-1對于軟骨，尤其是頜面部耳廓軟骨發(fā)育的作用仍罕見報(bào)道。在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) Ckip-1基因敲除(Ckip-1－/－)小鼠呈現(xiàn)小耳畸形，本研究將系統(tǒng)的從動物表型、組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)及相關(guān)細(xì)胞因子檢測等方面評估Ckip-1在小鼠耳廓軟骨發(fā)育中的作用，以期為小耳畸形的病因?qū)W提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取清潔級Ckip-1雜合子C57小鼠(軍事科學(xué)院構(gòu)建)交配生育后取鼠尾組織，PCR鑒定基因型，選取同窩同性別的基因敲除型(Ckip-1 knockout，Ckip-1－/－) 小鼠及野生型(Wild Type，WT)小鼠做配對實(shí)驗(yàn)。取6月齡Ckip-1－/－小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，WT小鼠為對照組(n=6、同窩同性別、雄性)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基(Hy-Clone，美國);100 ml/L新生牛血清(Gibco，美國);10 g/L青霉素/鏈霉素、引物(GeneRay，上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司);噻唑藍(lán)(MTT，Sigma，美國);DMSO(上海生工生物工程股份有限公司);總RNA提取試劑、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(RNAiso Plus，寶生物工程大連有限公司);Trizol試劑盒(上海普飛生物技術(shù)有限公司);掃描電鏡(JEDL，日本);分光光度計(jì)(BioTek，美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物表型觀察 取6月齡Ckip-1－/－和WT小鼠(n=6、同窩同性別、雄性)，經(jīng)1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)適度麻醉下，以耳廓基部線為基準(zhǔn)，觀察并測量小鼠耳廓整體形態(tài)及邊緣位置。

1.2.2 甲苯胺藍(lán)染色 過量麻醉處死動物，解剖取耳廓組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)切片。用0.5%甲苯胺藍(lán)水溶液(甲苯胺藍(lán)0.5 g，蒸餾水100 ml，常溫保存)置50～60℃溫箱染色30 min，雙蒸水洗去多余的染液，無水乙醇脫水，中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察染色情況并拍照記錄。

1.2.3 ATDC5細(xì)胞系培養(yǎng) ATDC5細(xì)胞置于培養(yǎng)基(DMEM/F12)中，加入10%胎牛血清、50 U/ml青霉素、50 U/ml鏈霉素。1次/3 d換液，保持細(xì)胞的對數(shù)生長，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2。

1.2.4 細(xì)胞模型準(zhǔn)備——慢病毒轉(zhuǎn)染及分組 Ckip-1干涉慢病毒載體信息:hU6-MCS-Ubiquitin-EGFPIRES-puromycin;靶點(diǎn)序列:5'-CCTGAGTGACTATGAGAAG-3'(上海吉?jiǎng)P基因)。將ATDC5細(xì)胞制成3×104～5×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液，鋪12孔板，每孔1 ml;待細(xì)胞達(dá)到20%左右密度時(shí)在感染增強(qiáng)液Eni.S和polybrene輔助下進(jìn)行感染，感染后8 h換液，感染后72 h進(jìn)行熒光拍照。收集細(xì)胞抽提RNA及蛋白進(jìn)行QPCR、Western blot檢測。分組為:敲低組(Ckip-1干涉慢病毒感染組)、陰性對照組(陰性慢病毒感染組)、空白對照組(未經(jīng)慢病毒感染組)。

1.2.5 QPCR檢測mRNA表達(dá)情況 總RNA提取使用Trizol試劑盒，cDNA合成使用M-MLV試劑盒。采用FTC-3000型實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測mRNA表達(dá)。應(yīng)用相應(yīng)引物進(jìn)行擴(kuò)增，以 β-actin為對照，應(yīng)用2－ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)量差異。

1.2.6 掃描電鏡檢測 標(biāo)本以2.5%戊二醛固定、脫水、干燥、噴金，SEM下觀察細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞連接情況。

1.2.7 MTT 實(shí)驗(yàn) 在預(yù)設(shè)的時(shí)間點(diǎn)(1、2、3、4、5、6 d)，吸出培養(yǎng)基，加入MTT溶液后孵育4 h。吸去培養(yǎng)基，PBS沖洗，每孔加入150μl二甲基亞砜(DMSO)。每孔取出100μl溶液轉(zhuǎn)移至96孔酶標(biāo)板，測定570 nm處溶液的吸光值。

1.2.8 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 于直徑60 mm培養(yǎng)皿中各接種1 000個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)3 d后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，甲醇固定15 min。1%亞甲基藍(lán)染液染色30 min后，去離子水清洗后晾干，計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)克隆形成率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)珋x±s進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ckip-1－/－小鼠耳廓表型及組織學(xué)分析

Ckip-1－/－小鼠表現(xiàn)為小耳畸形，具體為:①耳廓長徑、寬徑的同時(shí)縮小，整體呈蜷縮狀不伸展(圖1A、1C)。②甲苯胺藍(lán)染色顯示，WT型小鼠耳廓軟骨板橫斷面呈現(xiàn)雙層軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)，成熟軟骨細(xì)胞較多，周邊散在幼稚軟骨細(xì)胞(圖1D);而Ckip-1－/－小鼠耳廓軟骨板橫斷面呈現(xiàn)多層結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)紊亂邊緣不齊，可見大量幼稚軟骨細(xì)胞，軟骨成熟度較低(圖1B)。

2.2 Ckip-1對小鼠ATDC5軟骨細(xì)胞系功能的影響

siRNA干擾技術(shù)對ATDC5細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率大于90%，細(xì)胞內(nèi)Ckip-1轉(zhuǎn)錄及翻譯水平均被下調(diào)(圖2)，成功構(gòu)建了Ckip-1敲低的體外細(xì)胞模型。

2.2.1 Ckip-1下調(diào)引起軟骨細(xì)胞形態(tài)改變 光鏡下觀察可見敲低組軟骨細(xì)胞伸展范圍增大，細(xì)胞突觸增多、增粗，細(xì)胞由三角形向多角形轉(zhuǎn)變。同時(shí)胞內(nèi)可見更多顆粒物，細(xì)胞核更為明顯(圖3)。電鏡觀察可見，在長期培養(yǎng)后，陰性對照組細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的極性，細(xì)胞沿某一方向伸展(圖3)，而敲低組中，細(xì)胞伸展范圍較大，細(xì)胞極性不明顯，呈現(xiàn)較為“雜亂”的排布方式。

2.2.2 Ckip-1下調(diào)引起軟骨細(xì)胞增殖能力改變Ckip-1下調(diào)引起軟骨細(xì)胞增殖能力改變，具體:①與陰性對照組相比，敲低組細(xì)胞自第3日起開始呈現(xiàn)顯著的增殖抑制現(xiàn)象(圖4);②克隆形成實(shí)驗(yàn)也得到相似結(jié)果，即敲低組細(xì)胞克隆形成率顯著降低，提示細(xì)胞貼壁數(shù)量或單個(gè)細(xì)胞增殖能力下降(圖4)。

圖1 Ckip-1－/－小鼠耳廓大體及組織學(xué)表型Fig 1 The macroscopic and histologic phenotype of the auricle of Ckip-1 －/－ and WT mice

2.3 Ckip-1對軟骨分化關(guān)鍵分子的影響

利用QPCR技術(shù)，探究Ckip-1下調(diào)對于軟骨細(xì)胞分子層面的影響，具體:① Ckip-1下調(diào)在軟骨細(xì)胞中可激活Bmp信號通路，與骨組織相似;②敲低組軟骨早期分化關(guān)鍵分子Sox9水平上升(圖5);但軟骨細(xì)胞主要功能分子Col II的水平下降(圖5);③敲低組軟骨肥大化標(biāo)志物Runx2與Col X呈現(xiàn)相反的變化趨勢(圖5)，其具體原因有待進(jìn)一步證明。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過動物現(xiàn)象觀察、組織切片分析、細(xì)胞功能評估及關(guān)鍵分子檢測等不同層面，系統(tǒng)研究Ckip-1對小鼠耳廓軟骨發(fā)育畸形的可能原因，對解釋病因及臨床診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。Ckip-1分子在細(xì)胞內(nèi)廣泛分布，其分子結(jié)構(gòu)包括在N端的血小板－白細(xì)胞C激酶底物相關(guān)結(jié)構(gòu)域(Pleckstrin Homology，PH)，C端的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(Leucine Zipper，LZ)等多個(gè)分子結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)為其提供了介導(dǎo)多種蛋白及基因生物學(xué)行為的可能［7］。而其對軟骨組織及細(xì)胞的影響可能基于以下幾方面:

A:轉(zhuǎn)染效率;B:Ckip-1轉(zhuǎn)錄水平(QPCR);C:Ckip-1蛋白翻譯水平(Western Blot)圖2 siRNA干擾技術(shù)建立Ckip-1下調(diào)的ATDC5軟骨細(xì)胞系A(chǔ):Transfection efficiency;B:Ckip-1 mRNA expression;C:Ckip-1 protein expressionFig 2 Down-regulation of Ckip-1 in ATDC5 chondroncytes by siRNA

3.1 Ckip-1調(diào)控軟骨細(xì)胞生存

細(xì)胞生存狀態(tài)直接決定了細(xì)胞功能的行使甚至組織的構(gòu)成。本實(shí)驗(yàn)中，敲低組ATDC5中，細(xì)胞出現(xiàn)增殖及生存能力減弱的現(xiàn)象，這可能是由于Ckip-1對細(xì)胞的生存具有調(diào)控作用。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，Ckip-1蛋白可以被Caspase-3在D310到D345區(qū)域裂解后入核，并通過直接結(jié)合或者抑制c-Jun磷酸化等方式發(fā)揮對AP-1的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［8］。同時(shí)，Ckip-1也能通過上調(diào)p53 N-末端絲氨酸-15的磷酸化水平來抑制p53的降解，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖能力［9］。但在肺癌的研究中，卻得到相反的結(jié)論，下調(diào)Ckip-1基因水平可以有效抑制肺癌H1299細(xì)胞系的增殖和克隆形成能力，導(dǎo)致S期細(xì)胞周期阻滯和G2期的推廣，以及顯著增強(qiáng)H1299細(xì)胞系凋亡［10］，同時(shí)這表明Ckip-1對于細(xì)胞生存的調(diào)節(jié)存在細(xì)胞特異性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ckip-1在軟骨細(xì)胞生存中的作用與大多數(shù)組織，尤其是骨組織的顯著差異，并最終導(dǎo)致動物小耳畸形的發(fā)生，提示Ckip-1的穩(wěn)態(tài)對顱頜面組織發(fā)育的重要意義。

圖3 Ckip-1對ATDC5軟骨細(xì)胞系細(xì)胞形態(tài)影響Fig 3 The effect of Ckip-1 on the cell morphology of ATDC5 chondrocytes

圖4 Ckip-1對ATDC5軟骨細(xì)胞系細(xì)胞生存能力影響Fig 4 The effect of Ckip-1 on the proliferation of ATDC5 chondrocytes

圖5 Ckip-1對ATDC5軟骨細(xì)胞系分化關(guān)鍵因子表達(dá)的影響Fig 5 The effect of Ckip-1 on the mRNA level of chodrocyte differentiation related factors in ATDC5 chondrocytes(QPCR)

3.2 Ckip-1調(diào)控軟骨組織微觀結(jié)構(gòu)

軟骨組織由軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)等構(gòu)成，其中，軟骨細(xì)胞形態(tài)及軟骨細(xì)胞間連接狀態(tài)等在軟骨組織微觀結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)中，下調(diào)Ckip-1將導(dǎo)致軟骨細(xì)胞伸展范圍的增加，而電鏡結(jié)果也顯示更多板狀偽足的產(chǎn)生。這可能是由于Ckip-1對于細(xì)胞骨架具有調(diào)節(jié)作用。研究報(bào)道，Ckip-1可以通過抑制CP(一種廣泛表達(dá)的異源二聚體，其可綁定到肌動蛋白絲上并發(fā)揮阻止添加或移除活性亞基的作用)，進(jìn)而促進(jìn)肌動蛋白絲的延伸而抑制其分叉［11-13］，這解釋了細(xì)胞偽足的多方向伸展?fàn)顟B(tài)。同時(shí)，腫瘤學(xué)的研究也證實(shí)，Ckip-1可以通過Ckip-1/CK2/PAK1通路對基于細(xì)胞骨架功能的質(zhì)膜變形和細(xì)胞遷移產(chǎn)生作用［14］。而這種細(xì)胞偽足功能的改變，將對細(xì)胞的連接及遷移產(chǎn)生影響，引起細(xì)胞分散和極性降低，并可能最終導(dǎo)致軟骨組織微結(jié)構(gòu)的不良，而這與組織學(xué)切片結(jié)果中軟骨板形態(tài)不甚規(guī)則相一致。

3.3 Ckip-1調(diào)控軟骨分化

軟骨分化是軟骨組織行使功能的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)中，下調(diào)Ckip-1導(dǎo)致:①Sox9水平升高，而Sox9作為軟骨早期分化的重要標(biāo)志物，可通過結(jié)合于PTHrP基因的啟動子區(qū)并增加該啟動子活性等方式，進(jìn)而促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和分化;② Runx2水平下降，而Runx2是軟骨形成過程中礦物沉積階段的特征性產(chǎn)物，其表達(dá)降低將導(dǎo)致軟骨細(xì)胞成熟進(jìn)程減緩［15－17］;③ 軟骨膠原分泌改變，本實(shí)驗(yàn)中，II型膠原的降低與X型膠原升高相伴，提示軟骨基質(zhì)分泌不良，但是否同時(shí)指明軟骨朝末期分化加速仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明［18－20］;④Bmp信號通路的激活，與骨中較為類似，但不同的細(xì)胞生理效應(yīng)提示其可能同時(shí)通過其他通路影響軟骨發(fā)育［21］。這些結(jié)果共同解釋了本實(shí)驗(yàn)中組織學(xué)分析中，軟骨細(xì)胞成熟程度降低這一現(xiàn)象。

4 總結(jié)

在耳廓軟骨發(fā)育過程中，Ckip-1可能通過改善細(xì)胞增殖及生存狀態(tài)，調(diào)節(jié)分化進(jìn)程等途徑發(fā)揮重要作用，其缺乏將導(dǎo)致小鼠小耳畸形。

［1］ 林琳，潘博，蔣海越，等.小耳畸形家系的基因定位及候選基因篩查初步研究［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2013，21(6):17－19.

［2］ Luquetti DV，Leoncini E，Mastroiacovo P.Microtia-anotia:A global review of prevalence rates［J］.Birth Defects Res A Clin Mol Teratol，2011，91(9):813 －822.

［3］ Zhang YB，Hu J，Zhang J，et al.Genome-wide association study identifies multiple susceptibility loci for craniofacial microsomia［J］.Nat Commun，2016，7:10605.

［4］ Zhang L，Wu K，Song W，et al.Chitosan/siCkip-1 biofunctionalized titanium implant for improved osseointegration in the osteoporotic condition［J］.Sci Rep，2015，5:10860.

［5］ Zhou ZC，Che L，Kong L，et al.CKIP-1 silencing promotes new bone formation in rat mandibular distraction osteogenesis［J］.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol，2017，123(1):e1－e9.

［6］ 秦東澤，胡奧，郭威孝，等.CKIP-1對不同時(shí)間和部位松質(zhì)骨影響的Micro-CT分析［J］.口腔醫(yī)學(xué)，2017，37(3):198－202.

［7］ Nie J，Liu L，He F，et al.CKIP-1:A scaffold protein and potential therapeutic target integrating multiple signaling pathways and physiological functions［J］.Ageing Res Rev，2013，12(1):276－281.

［8］ Zhang L，Xing G，Tie Y，et al.Role for the pleckstrin homology domain-containing protein CKIP-1 in AP-1 regulation and apoptosis［J］.EMBOJ，2005，24(4):766 －778.

［9］ Zhang L，Tie Y，Tian C，et al.CKIP-1 recruits nuclear ATM partially to the plasma membrane through interaction with ATM［J］.Cell Signal，2006，18(9):1386 －1395.

［10］ Chen GM，Ding RF，Tan YD，et al.Role of the CKIP1 gene in proliferation and apoptosis of the human lung cancer cell line H1299［J］.Genet Mol Res，2015，14(2):4005－4014.

［11］ Bruck S，Huber TB，Ingham RJ，et al.Identification of a novel inhibitory actin-capping protein binding motif in CD2-associated protein［J］.J Biol Chem，2006，281(28):19196－19203.

［12］ Canton DA，Olsten ME，Niederstrasser H，et al.The role of CKIP-1 in cell morphology depends on its interaction with actin-capping protein［J］.J Biol Chem，2006，281(47):36347－36359.

［13］ Canton DA，Olsten ME，Kim K，et al.The pleckstrin homology domain-containing protein CKIP-1 is involved in regulation of cell morphology and the actin cytoskeleton and interaction with actin capping protein［J］.Mol Cell Biol，2005，25(9):3519－3534.

［14］ Kim YB，Shin YJ，Roy A，et al.The role of the pleckstrin homology domain-containing protein CKIP-1 in activation of p21-activated kinase 1(PAK1)［J］.J Biol Chem，2015，290(34):21076－21085.

［15］ Komori T.Runx2，a multifunctional transcription factor in skeletal development［J］.JCell Biochem，2002，87(1):1－8.

［16］ Zheng Q，Zhou G，Morello R，et al.Type X collagen gene regulation by Runx2 contributes directly to its hypertrophic chondrocyte-specific expression in vivo［J］.J Cell Biol，2003，162(5):833－842.

［17］ Zhang Y，Yang TL，Li X，et al.Functional analyses reveal the essential role of SOX6 and RUNX2 in the communication of chondrocyte and osteoblast［J］.Osteoporos Int，2015，26(2):553－561.

［18］ Narcisi R，Quarto R，Ulivi V，et al.TGF β-1 administration during ex vivo expansion of human articular chondrocytes in a serum-free medium redirects the cell phenotype toward hypertrophy［J］.J Cell Physiol，2012，227(9):3282－3290.

［19］ Ahmad PJ，Trcka D，Xue S，et al.Discoidin domain receptor-1 deficiency attenuates atherosclerotic calcification and smooth muscle cell-mediated mineralization［J］.Am J Pathol，2009，175(6):2686 －2696.

［20］ Aigner T，Neureiter D，Campean V，et al.Expression of cartilage-specific markers in calcified and non-calcified atherosclerotic lesions［J］.Atherosclerosis，2008，196(1):37－41.

［21］ 田曉光，沈舒寧，段銀鐘，等.CKIP-1對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖和分化能力的影響［J］.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2016，32(1):10－14.