金培峰，王業(yè)煥，姜盛，張浩，孫成超

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心胸外科，浙江 溫州 325015；2.岳陽市第一人民醫(yī)院 急診科，湖南岳陽 414000；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院 心外科，北京 100037）

研究表明在心肌梗死（myocardial infarction，MI）后移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）能夠有效改善心功能[1-2]。將BMSCs直接注射入MI區(qū)域被認(rèn)為是效果最佳的移植途徑之一，但MI的不同部位對移植的BMSCs有著不同的影響，MI的中央?yún)^(qū)（即瘢痕區(qū)域）雖然不利于移植細(xì)胞的存活，但該部位卻是最需要心肌的再生；而MI的邊緣區(qū)域由于擁有較豐富的血液供應(yīng)，有助于移植細(xì)胞的存活，但較多的血運會使移植的細(xì)胞發(fā)生心外逃逸現(xiàn)象，從而影響移植效果[3-4]。

本研究將BMSCs通過注射的方式分別移植入MI的中央?yún)^(qū)和邊緣區(qū)，并檢測其存活情況、促進血管新生以及在改善心功能方面的差別，從而為BMSCs在臨床應(yīng)用中提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：60只雌性Lewis大鼠（體質(zhì)量200～220 g）用來制作MI模型；5只雄性Lewis大鼠（體質(zhì)量60～80 g）用來培養(yǎng)BMSCs。實驗動物均由溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證號：SCXY（浙）2015-0001。

1.1.2 主要試劑：DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（美國Gibco公司），5-溴尿嘧啶（Brdu）（美國Sigma公司），胰酶（美國Sigma公司），Von Willebrand factor抗體（美國Santa Cruz公司），DAB顯色液（北京中杉金橋公司），所有引物由大連TaKaRa公司設(shè)計合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和標(biāo)記：無菌條件下分離大鼠的股骨和脛骨，以全骨髓貼壁法分離并培養(yǎng)BMSCs，待狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞生長達到50%～60%匯合時，用含10 μmol/L Brdu的DMEM（含10%胎牛血清）培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基后，繼續(xù)培養(yǎng)36 h[5-6]。

1.2.2 MI模型的制作：雌性Lewis大鼠在小型動物呼吸機和水合氯醛麻醉下，左進胸結(jié)扎左冠狀動脈前降支[7]。術(shù)后3周心臟超聲檢查，只有出現(xiàn)明顯左室前壁變薄以及同時滿足左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）＜60%和左室縮短分?jǐn)?shù)（left ventricular fractional shortening，LVFS）＜30%的動物才予以進入下輪實驗。存活的合格大鼠隨機分為4組，每組12只，即MI邊緣區(qū)細(xì)胞移植組（BZC組）、MI中央?yún)^(qū)細(xì)胞移植組（CZC組）、MI邊緣區(qū)PBS組（BZP組）和MI中央?yún)^(qū)PBS組（CZP組），并為下一步移植實驗做準(zhǔn)備。

1.2.3 細(xì)胞移植：MI 3周后將大鼠麻醉后在左胸第5肋間開胸，用胰島素針抽取含有3×106個Brdu標(biāo)記BMSCs的PBS懸混液50 μL。在BZC組將細(xì)胞懸液注射入MI邊緣區(qū)，在CZC組將相同體積的細(xì)胞懸液注射于MI中央?yún)^(qū)。作為對照，BZP組和CZP組分別于邊緣區(qū)和中央?yún)^(qū)注射50 μL的PBS，見圖1A-B。

1.2.4 Real-time PCR檢測：分別在細(xì)胞移植后的24 h和4周處死動物，取心臟作移植細(xì)胞的定量檢測。DNA利用Wizard Genomic DNA Purification Kit提取，提取后的DNA用100 μL試劑盒中的DNA再溶解液溶解，用分光光度測定法測定DNA的總量。實驗采用SYBR-Green I熒光染料技術(shù)。應(yīng)用7300 Real-time PCR System（美國ABI公司）對外源雄性動物的BMSCs進行定量。目的基因位于雄性大鼠Y染色體性別決定區(qū)（sex determining region of Y chromosome，SRY）上一段特定的序列。2對引物（10 μmol/L）分別為5’-CATCGAAGGGTTAAAGTGCCA-3’和5’-ATAGTGTGTAGGTTGTTGTCC-3’，環(huán)境條件是：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min。所取材中的雄細(xì)胞總數(shù)=Real-time PCR檢測所得SRY的平均數(shù)×被檢DNA的稀釋倍數(shù)×原取材重量（mg）/用來提取DNA的標(biāo)本重量（mg）。

1.2.5 心功能評價：細(xì)胞移植后第4周，再次心臟超聲檢查，記錄LVEF和LVFS值。心臟超聲檢測完畢后處死動物，取心臟做組織學(xué)檢測。

1.2.6 組織學(xué)觀察：①毛細(xì)血管密度的檢測：用VI I I因子染色后在200倍顯微鏡下在瘢痕區(qū)內(nèi)計數(shù)，血管數(shù)目=血管數(shù)/0.2 mm2。②干細(xì)胞失蹤的檢測：主要通過免疫組織化學(xué)法，標(biāo)識Brdu預(yù)染的干細(xì)胞。兩者主要方法為切片脫蠟后使用胃蛋白酶修復(fù)抗原，并添加抗體置于濕盒內(nèi)過夜，之后使用通用的標(biāo)準(zhǔn)方法染色。

1.2.7 MI后左室重塑的檢測：心臟橫截面的石蠟切片用HE染色，Olympus DP70拍攝后用Image-Pro Plus 5.0軟件分析，其主要檢測的指標(biāo)為心臟的膨脹系數(shù)：①室間隔和MI中央?yún)^(qū)的瘢痕厚度；②左室腔的面積和整個左心室的面積。膨脹系數(shù)=（左室腔面積/整個左室面積）×（室間隔厚度/瘢痕厚度）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料用±s表示。各組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的標(biāo)識和存活率檢測 細(xì)胞移植后Brdu標(biāo)記的BMSCs確定是分別局限于原來的注射區(qū)域（邊緣區(qū)或中央?yún)^(qū)），很少發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞向其他部位遷移的現(xiàn)象，見圖1C-D。Real-time PCR顯示BZC組移植細(xì)胞在24 h和4周的存活率分別為15.74%±4.13%和5.57%±1.13%，所檢測到的存活量均顯著高于同一時間點的CZC組（8.2%±2.63%和1.72%±0.41%），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

圖1 BMSCs細(xì)胞在移植部位的示蹤

圖2 BMSCs移植后24 h和4周Reali-time PCR所檢測到的細(xì)胞存活率

2.2 心功能和心室重塑的評價 細(xì)胞移植前4組大鼠心功能LVEF、LVFS以及心臟大小、體質(zhì)量等指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞移植治療后4周，與CZC組、CZP組和BZP組相比，BZC組LVEF和LVFS均顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而CZC、CZP和BZP 3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.3 新生血管檢測 與其他3組比，BZC組的細(xì)胞移植局部區(qū)域毛細(xì)血管生成數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3-4。

2.4 心臟形態(tài)學(xué)的評價 細(xì)胞移植均能有效增加邊緣區(qū)和中央?yún)^(qū)瘢痕厚度，與BZP組和CZP組比，BZC組和CZC組瘢痕厚度均有顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。膨脹系數(shù)檢測結(jié)果顯示，BZC組明顯低于CZC組、BZP組和CZP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖5。

3 討論

細(xì)胞移植后細(xì)胞在MI部位的存活量是影響療效的一個重要因素，這也是本研究首要的檢測指標(biāo)。本研究通過檢測SRY基因的方法來對移植的雄性干細(xì)胞進行定量檢測。隨著時間的延長，在BZC組和CZC組移植細(xì)胞均在逐步降低，但BZC組的細(xì)胞存活量顯著多于CZC組，在移植后第1天是CZC組的2倍，4周時是CZC組的3倍。移植細(xì)胞心內(nèi)滯留和存活量的減少可能與經(jīng)MI區(qū)殘存的血管逃逸和MI部位的炎癥、缺氧及機械原因所導(dǎo)致的細(xì)胞丟失有關(guān)[3，8]。雖然MI邊緣區(qū)殘存的毛細(xì)血管量明顯多于MI中央?yún)^(qū)，從而可能加重細(xì)胞向心外臟器遷移，但相對豐富的血液供應(yīng)對移植細(xì)胞的存活起著關(guān)鍵作用。所以總體而言，BZC組的細(xì)胞存活顯著高于CZC組。但無論選擇何種部位移植，4周后存活的細(xì)胞數(shù)均銳減，所以需要通過其他一些手段如轉(zhuǎn)染抗缺氧的基因等進一步提高細(xì)胞的遠(yuǎn)期存活率。

表1 細(xì)胞移植4周后心功能和心室重塑指標(biāo)的變化（n=12， ±s）

表1 細(xì)胞移植4周后心功能和心室重塑指標(biāo)的變化（n=12， ±s）

與其他3組比：aP＜0.05；LVEDd為左室舒張期末內(nèi)徑，LVESd為左室收縮期末內(nèi)徑

組別 LVEDd（mm） LVESd（mm） LVEF（%） LVFS（%）CZC組 7.62±0.64 5.86±0.57 51.88±3.88 21.13±2.19 BZC組 7.25±0.78 5.38±0.59 57.48±3.73a 26.42±2.32a CZP組 7.74±0.69 5.99±0.67 50.90±3.58 22.60±1.95 BZP組 8.11±0.49 6.49±0.73 48.47±4.65 22.55±4.35

圖3 細(xì)胞移植促進移植部位的新生血管生成（免疫組織化學(xué)法）

圖4 各組毛細(xì)血管數(shù)量（VI I I因子染色）

在BMSCs移植后促進移植部位及周邊部位的血管新生是促進心功能改善的一個重要因素[9]，BMSCs所分泌的各種細(xì)胞因子（如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等）對血管的新生起著非常重要的作用。因此移植后細(xì)胞存活量直接影響著促血管新生的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在本研究中，雖然中央?yún)^(qū)移植也可以促進局部血管新生，但其密度遠(yuǎn)低于邊緣區(qū)。毛細(xì)血管的增多改善了MI部位的微環(huán)境，而微環(huán)境的改善反過來促進了后期移植細(xì)胞的增殖。而移植細(xì)胞在MI中央?yún)^(qū)的低存活量限制了其促血管新生的作用。

Hochman-Choo膨脹系數(shù)對于MI后心臟膨脹度能起到較好的量化作用[10]。細(xì)胞經(jīng)邊緣區(qū)注射能更有效地促進瘢痕面積的縮小和降低MI心臟的膨脹系數(shù)。表明對MI后進行BMSCs的移植能夠抑制心臟的形態(tài)學(xué)進一步擴張，對心臟起到類似于組織繃帶的作用，能夠有效地降低心臟的矛盾運動，從而使心功能的繼續(xù)惡化得到有效抑制。研究也表明，邊緣區(qū)移植能更有效地通過調(diào)整局部金屬基質(zhì)酶等的表達，從而促進心室的逆向重構(gòu)[11]。

雖然在MI后移植細(xì)胞能夠明確有效地改善心功能，但在MI的邊緣區(qū)用注射的方法移植能夠更有利于移植細(xì)胞的存活，并更有效地促進新生血管的形成，改善心臟形態(tài)的重構(gòu)和提高心功能的作用。在將來的開胸條件下進行直視細(xì)胞移植的研究中，如果移植細(xì)胞的數(shù)量有限，應(yīng)該優(yōu)先考慮對MI的邊緣區(qū)進行移植。但在移植細(xì)胞數(shù)量充足的條件下，MI中央?yún)^(qū)也不應(yīng)被忽略，因為其也能在一定程度上有效地促進血管新生和重塑瘢痕的作用。

圖5 BMSCs移植后改善MI后的心肌重塑情況

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