金培峰，王業(yè)煥，姜盛，張浩，孫成超

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心胸外科，浙江 溫州 325015；2.岳陽(yáng)市第一人民醫(yī)院 急診科，湖南岳陽(yáng) 414000；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院 心外科，北京 100037）

研究表明在心肌梗死（myocardial infarction，MI）后移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）能夠有效改善心功能[1-2]。將BMSCs直接注射入MI區(qū)域被認(rèn)為是效果最佳的移植途徑之一，但MI的不同部位對(duì)移植的BMSCs有著不同的影響，MI的中央?yún)^(qū)（即瘢痕區(qū)域）雖然不利于移植細(xì)胞的存活，但該部位卻是最需要心肌的再生；而MI的邊緣區(qū)域由于擁有較豐富的血液供應(yīng)，有助于移植細(xì)胞的存活，但較多的血運(yùn)會(huì)使移植的細(xì)胞發(fā)生心外逃逸現(xiàn)象，從而影響移植效果[3-4]。

本研究將BMSCs通過(guò)注射的方式分別移植入MI的中央?yún)^(qū)和邊緣區(qū)，并檢測(cè)其存活情況、促進(jìn)血管新生以及在改善心功能方面的差別，從而為BMSCs在臨床應(yīng)用中提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：60只雌性Lewis大鼠（體質(zhì)量200～220 g）用來(lái)制作MI模型；5只雄性Lewis大鼠（體質(zhì)量60～80 g）用來(lái)培養(yǎng)BMSCs。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXY（浙）2015-0001。

1.1.2 主要試劑：DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），5-溴尿嘧啶（Brdu）（美國(guó)Sigma公司），胰酶（美國(guó)Sigma公司），Von Willebrand factor抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），DAB顯色液（北京中杉金橋公司），所有引物由大連TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和標(biāo)記：無(wú)菌條件下分離大鼠的股骨和脛骨，以全骨髓貼壁法分離并培養(yǎng)BMSCs，待狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到50%～60%匯合時(shí)，用含10 μmol/L Brdu的DMEM（含10%胎牛血清）培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基后，繼續(xù)培養(yǎng)36 h[5-6]。

1.2.2 MI模型的制作：雌性Lewis大鼠在小型動(dòng)物呼吸機(jī)和水合氯醛麻醉下，左進(jìn)胸結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支[7]。術(shù)后3周心臟超聲檢查，只有出現(xiàn)明顯左室前壁變薄以及同時(shí)滿(mǎn)足左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）＜60%和左室縮短分?jǐn)?shù)（left ventricular fractional shortening，LVFS）＜30%的動(dòng)物才予以進(jìn)入下輪實(shí)驗(yàn)。存活的合格大鼠隨機(jī)分為4組，每組12只，即MI邊緣區(qū)細(xì)胞移植組（BZC組）、MI中央?yún)^(qū)細(xì)胞移植組（CZC組）、MI邊緣區(qū)PBS組（BZP組）和MI中央?yún)^(qū)PBS組（CZP組），并為下一步移植實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1.2.3 細(xì)胞移植：MI 3周后將大鼠麻醉后在左胸第5肋間開(kāi)胸，用胰島素針抽取含有3×106個(gè)Brdu標(biāo)記BMSCs的PBS懸混液50 μL。在BZC組將細(xì)胞懸液注射入MI邊緣區(qū)，在CZC組將相同體積的細(xì)胞懸液注射于MI中央?yún)^(qū)。作為對(duì)照，BZP組和CZP組分別于邊緣區(qū)和中央?yún)^(qū)注射50 μL的PBS，見(jiàn)圖1A-B。

1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)：分別在細(xì)胞移植后的24 h和4周處死動(dòng)物，取心臟作移植細(xì)胞的定量檢測(cè)。DNA利用Wizard Genomic DNA Purification Kit提取，提取后的DNA用100 μL試劑盒中的DNA再溶解液溶解，用分光光度測(cè)定法測(cè)定DNA的總量。實(shí)驗(yàn)采用SYBR-Green I熒光染料技術(shù)。應(yīng)用7300 Real-time PCR System（美國(guó)ABI公司）對(duì)外源雄性動(dòng)物的BMSCs進(jìn)行定量。目的基因位于雄性大鼠Y染色體性別決定區(qū)（sex determining region of Y chromosome，SRY）上一段特定的序列。2對(duì)引物（10 μmol/L）分別為5’-CATCGAAGGGTTAAAGTGCCA-3’和5’-ATAGTGTGTAGGTTGTTGTCC-3’，環(huán)境條件是：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min。所取材中的雄細(xì)胞總數(shù)=Real-time PCR檢測(cè)所得SRY的平均數(shù)×被檢DNA的稀釋倍數(shù)×原取材重量（mg）/用來(lái)提取DNA的標(biāo)本重量（mg）。

1.2.5 心功能評(píng)價(jià)：細(xì)胞移植后第4周，再次心臟超聲檢查，記錄LVEF和LVFS值。心臟超聲檢測(cè)完畢后處死動(dòng)物，取心臟做組織學(xué)檢測(cè)。

1.2.6 組織學(xué)觀察：①毛細(xì)血管密度的檢測(cè)：用VI I I因子染色后在200倍顯微鏡下在瘢痕區(qū)內(nèi)計(jì)數(shù)，血管數(shù)目=血管數(shù)/0.2 mm2。②干細(xì)胞失蹤的檢測(cè)：主要通過(guò)免疫組織化學(xué)法，標(biāo)識(shí)Brdu預(yù)染的干細(xì)胞。兩者主要方法為切片脫蠟后使用胃蛋白酶修復(fù)抗原，并添加抗體置于濕盒內(nèi)過(guò)夜，之后使用通用的標(biāo)準(zhǔn)方法染色。

1.2.7 MI后左室重塑的檢測(cè)：心臟橫截面的石蠟切片用HE染色，Olympus DP70拍攝后用Image-Pro Plus 5.0軟件分析，其主要檢測(cè)的指標(biāo)為心臟的膨脹系數(shù)：①室間隔和MI中央?yún)^(qū)的瘢痕厚度；②左室腔的面積和整個(gè)左心室的面積。膨脹系數(shù)=（左室腔面積/整個(gè)左室面積）×（室間隔厚度/瘢痕厚度）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用±s表示。各組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的標(biāo)識(shí)和存活率檢測(cè) 細(xì)胞移植后Brdu標(biāo)記的BMSCs確定是分別局限于原來(lái)的注射區(qū)域（邊緣區(qū)或中央?yún)^(qū)），很少發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞向其他部位遷移的現(xiàn)象，見(jiàn)圖1C-D。Real-time PCR顯示BZC組移植細(xì)胞在24 h和4周的存活率分別為15.74%±4.13%和5.57%±1.13%，所檢測(cè)到的存活量均顯著高于同一時(shí)間點(diǎn)的CZC組（8.2%±2.63%和1.72%±0.41%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖1 BMSCs細(xì)胞在移植部位的示蹤

圖2 BMSCs移植后24 h和4周Reali-time PCR所檢測(cè)到的細(xì)胞存活率

2.2 心功能和心室重塑的評(píng)價(jià) 細(xì)胞移植前4組大鼠心功能LVEF、LVFS以及心臟大小、體質(zhì)量等指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞移植治療后4周，與CZC組、CZP組和BZP組相比，BZC組LVEF和LVFS均顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而CZC、CZP和BZP 3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.3 新生血管檢測(cè) 與其他3組比，BZC組的細(xì)胞移植局部區(qū)域毛細(xì)血管生成數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖3-4。

2.4 心臟形態(tài)學(xué)的評(píng)價(jià) 細(xì)胞移植均能有效增加邊緣區(qū)和中央?yún)^(qū)瘢痕厚度，與BZP組和CZP組比，BZC組和CZC組瘢痕厚度均有顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。膨脹系數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，BZC組明顯低于CZC組、BZP組和CZP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖5。

3 討論

細(xì)胞移植后細(xì)胞在MI部位的存活量是影響療效的一個(gè)重要因素，這也是本研究首要的檢測(cè)指標(biāo)。本研究通過(guò)檢測(cè)SRY基因的方法來(lái)對(duì)移植的雄性干細(xì)胞進(jìn)行定量檢測(cè)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在BZC組和CZC組移植細(xì)胞均在逐步降低，但BZC組的細(xì)胞存活量顯著多于CZC組，在移植后第1天是CZC組的2倍，4周時(shí)是CZC組的3倍。移植細(xì)胞心內(nèi)滯留和存活量的減少可能與經(jīng)MI區(qū)殘存的血管逃逸和MI部位的炎癥、缺氧及機(jī)械原因所導(dǎo)致的細(xì)胞丟失有關(guān)[3，8]。雖然MI邊緣區(qū)殘存的毛細(xì)血管量明顯多于MI中央?yún)^(qū)，從而可能加重細(xì)胞向心外臟器遷移，但相對(duì)豐富的血液供應(yīng)對(duì)移植細(xì)胞的存活起著關(guān)鍵作用。所以總體而言，BZC組的細(xì)胞存活顯著高于CZC組。但無(wú)論選擇何種部位移植，4周后存活的細(xì)胞數(shù)均銳減，所以需要通過(guò)其他一些手段如轉(zhuǎn)染抗缺氧的基因等進(jìn)一步提高細(xì)胞的遠(yuǎn)期存活率。

表1 細(xì)胞移植4周后心功能和心室重塑指標(biāo)的變化（n=12， ±s）

表1 細(xì)胞移植4周后心功能和心室重塑指標(biāo)的變化（n=12， ±s）

與其他3組比：aP＜0.05；LVEDd為左室舒張期末內(nèi)徑，LVESd為左室收縮期末內(nèi)徑

組別 LVEDd（mm） LVESd（mm） LVEF（%） LVFS（%）CZC組 7.62±0.64 5.86±0.57 51.88±3.88 21.13±2.19 BZC組 7.25±0.78 5.38±0.59 57.48±3.73a 26.42±2.32a CZP組 7.74±0.69 5.99±0.67 50.90±3.58 22.60±1.95 BZP組 8.11±0.49 6.49±0.73 48.47±4.65 22.55±4.35

圖3 細(xì)胞移植促進(jìn)移植部位的新生血管生成（免疫組織化學(xué)法）

圖4 各組毛細(xì)血管數(shù)量（VI I I因子染色）

在BMSCs移植后促進(jìn)移植部位及周邊部位的血管新生是促進(jìn)心功能改善的一個(gè)重要因素[9]，BMSCs所分泌的各種細(xì)胞因子（如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等）對(duì)血管的新生起著非常重要的作用。因此移植后細(xì)胞存活量直接影響著促血管新生的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在本研究中，雖然中央?yún)^(qū)移植也可以促進(jìn)局部血管新生，但其密度遠(yuǎn)低于邊緣區(qū)。毛細(xì)血管的增多改善了MI部位的微環(huán)境，而微環(huán)境的改善反過(guò)來(lái)促進(jìn)了后期移植細(xì)胞的增殖。而移植細(xì)胞在MI中央?yún)^(qū)的低存活量限制了其促血管新生的作用。

Hochman-Choo膨脹系數(shù)對(duì)于MI后心臟膨脹度能起到較好的量化作用[10]。細(xì)胞經(jīng)邊緣區(qū)注射能更有效地促進(jìn)瘢痕面積的縮小和降低MI心臟的膨脹系數(shù)。表明對(duì)MI后進(jìn)行BMSCs的移植能夠抑制心臟的形態(tài)學(xué)進(jìn)一步擴(kuò)張，對(duì)心臟起到類(lèi)似于組織繃帶的作用，能夠有效地降低心臟的矛盾運(yùn)動(dòng)，從而使心功能的繼續(xù)惡化得到有效抑制。研究也表明，邊緣區(qū)移植能更有效地通過(guò)調(diào)整局部金屬基質(zhì)酶等的表達(dá)，從而促進(jìn)心室的逆向重構(gòu)[11]。

雖然在MI后移植細(xì)胞能夠明確有效地改善心功能，但在MI的邊緣區(qū)用注射的方法移植能夠更有利于移植細(xì)胞的存活，并更有效地促進(jìn)新生血管的形成，改善心臟形態(tài)的重構(gòu)和提高心功能的作用。在將來(lái)的開(kāi)胸條件下進(jìn)行直視細(xì)胞移植的研究中，如果移植細(xì)胞的數(shù)量有限，應(yīng)該優(yōu)先考慮對(duì)MI的邊緣區(qū)進(jìn)行移植。但在移植細(xì)胞數(shù)量充足的條件下，MI中央?yún)^(qū)也不應(yīng)被忽略，因?yàn)槠湟材茉谝欢ǔ潭壬嫌行У卮龠M(jìn)血管新生和重塑瘢痕的作用。

圖5 BMSCs移植后改善MI后的心肌重塑情況

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