任曉燕，陳亞茹，時雯雯，鄭斌嬌，薛凌，管敏鑫

（溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035，1.檢驗醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院；2.Attardi線粒體生物醫(yī)學(xué)研究院）

高血壓是一種常見的慢性疾病，分為原發(fā)性高血壓和繼發(fā)性高血壓，其中原發(fā)性高血壓原因不明，約占全部高血壓的95%[1]，是一種由基因和環(huán)境等多種因素共同調(diào)控的疾病，遺傳方式主要涉及4種：常染色體顯性、常染色體隱性、性染色體連鎖和線粒體遺傳，線粒體基因突變已報道與原發(fā)性高血壓相關(guān)[2-4]。但線粒體基因突變并不是疾病發(fā)生的唯一條件[5]，核修飾基因同樣會參與線粒體基因突變導(dǎo)致的原發(fā)性高血壓表型的表達(dá)[6]，線粒體的功能不僅僅由線粒體基因調(diào)控，同時還需要核基因的參與。如線粒體蛋白翻譯過程中，OXPHOS受mtDNA和核基因雙重編碼，此外還有許多蛋白受核基因的編碼，在細(xì)胞質(zhì)合成后轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體發(fā)揮功能。同時，mtDNA的合成、復(fù)制以及編輯修飾過程等也由核基因編碼，因此，mtDNA結(jié)構(gòu)和功能的完整性與核基因存在密不可分的關(guān)系。本研究通過對原發(fā)性高血壓患者進(jìn)行臨床資料及基因組測序篩查，以線粒體tRNA基因突變和核基因YARS2基因突變作為切入點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)一個高外顯率的原發(fā)性高血壓家系攜帶線粒體tRNAMet（以下簡寫為m.）4435A＞G和YARS2c.5750A＞C突變，并通過生化功能實驗研究其對線粒體功能的影響，探討m.4435A＞G和YARS2c.5750A＞C突變與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1 對象 對同時攜帶m.4435A＞G突變和YARS2c.5750G＞T突變的原發(fā)性高血壓家系進(jìn)行樣本采集和臨床資料的完善，同時篩選并采集與突變組單體型相同的正常對照組樣本。將研究對象分為4組：正常對照組細(xì)胞株，單突變組細(xì)胞株僅攜帶m.4435A＞G突變，雙突變雜合組細(xì)胞株同時攜帶m.4435A＞G突變和YARS2c.5750A＞C雜合突變，雙突變純合組細(xì)胞株同時攜帶m.4435A＞G突變和YARS2c.5750A＞C純合突變。攜帶m.4435A＞G突變和YARS2c.5750A＞C突變的耳聾家系來自浙江省。攜帶YARS2c.5750A＞C單突變的樣本來自江西省。正常對照樣本來源于本課題組前期建立的正常樣本資源數(shù)據(jù)庫。參與本研究的患者家系及正常對照樣本人群均已按照溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委會管理規(guī)定的方法簽署知情同意書，符合倫理學(xué)規(guī)范，嚴(yán)格遵守倫理學(xué)規(guī)定和要求。構(gòu)建采集的突變樣本及正常對照樣本的永生化淋巴母細(xì)胞系，并利用基因測序等手段對轉(zhuǎn)化細(xì)胞的成功性進(jìn)行驗證。細(xì)胞系構(gòu)建成功后，我們分別檢測細(xì)胞的線粒體tRNA穩(wěn)態(tài)水平、細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成水平和線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）的變化。從而探究與原發(fā)性高血壓相關(guān)的m.4435A＞G突變和YARS2c.5750A＞C突變共同作用的分子致病機(jī)制。

1.2 方法

1.2.1 DNA序列的測定與分析：以提取的外周血全基因組DNA為模板，設(shè)計并合成線粒體24對引物（引物可完全覆蓋整個線粒體基因組序列）以及YARS2基因5對外顯子引物對已提取的樣本DNA進(jìn)行序列擴(kuò)增，通過PCR擴(kuò)增先證者、家系成員及對照組成員線粒體基因組序列，YARS2基因序列全部PCR產(chǎn)物純化后，將產(chǎn)物送至杭州擎科生物科技有限公司進(jìn)行DNA序列分析[7]。最后將反饋的測序峰圖與劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列修正版進(jìn)行序列分析比對，利用分析軟件Codoncode Aligner進(jìn)行突變篩查。先證者及其母系成員的線粒體基因全序列分析結(jié)果顯示，屬于東亞線粒體單體型G2。tRNAMet4435位點(diǎn)在進(jìn)化上高度保守，該位點(diǎn)對應(yīng)tRNAMet二級結(jié)構(gòu)反密碼子環(huán)的37位，m.4435A＞G突變可能影響與D莖13位和額外環(huán)46位的相互作用，進(jìn)而影響tRNAMet二級結(jié)構(gòu)的形成及穩(wěn)定性。

1.2.2 永生化淋巴母細(xì)胞系的建立：通過EB病毒轉(zhuǎn)化建立人類永生化外周血類淋巴母細(xì)胞系，其原理為EB病毒感染并與人外周血B淋巴細(xì)胞膜上的EB病毒受體結(jié)合后轉(zhuǎn)化細(xì)胞，產(chǎn)生可在體外長期傳代生長的淋巴母細(xì)胞系，表現(xiàn)出永生化的特征，使在體外研究細(xì)胞功能和分子遺傳機(jī)制變?yōu)榭赡躘8]，成為研究線粒體突變的最有效的工具。本研究建立的細(xì)胞系包括2個健康對照組和3個患者家系成員。

1.2.3 ROS檢測：利用美國Sigma公司ROS檢測試劑盒，通過流式細(xì)胞術(shù)分別檢測正常狀態(tài)及H2O2刺激后氧化應(yīng)激狀態(tài)下，突變型和野生型細(xì)胞株的ROS產(chǎn)量，對細(xì)胞內(nèi)的ROS水平進(jìn)行檢測評估[9-10]，通過對刺激前后熒光強(qiáng)度相對值的比較分析，即可反映出線粒體ROS水平[11-13]。

1.2.4 MMP檢測：使用美國Abcam公司MMP檢測試劑盒（JC-10）對細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，通過流式細(xì)胞術(shù)間接衡量線粒體膜電位水平。

1.2.5 tRNA穩(wěn)態(tài)水平檢測：為進(jìn)一步檢測m.4435A＞G突變以及YARS2c.5750A＞C突變對tRNAMet穩(wěn)態(tài)水平的影響，分別提取各樣本的線粒體RNA，并分別與地高辛標(biāo)記的線粒體tRNAMet、tRNATyr、tRNAGln、tRNAArg、tRNAHis和細(xì)胞的核基因編碼的5S RNA探針進(jìn)行Northern blot雜交實驗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 家系分析和臨床評估 圖1所示為家系圖。此家系共3代26名，母系成員15名，其中7名患原發(fā)性高血壓，患病率為46.6%，患者平均收縮壓為（150±5）mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），平均舒張壓為（89±10）mmHg；非母系成員無發(fā)病者。對家系患病成員進(jìn)行血常規(guī)、血生化檢查和病史調(diào)查，均無其他臨床綜合征表現(xiàn)，排除繼發(fā)性高血壓的可能。

圖1 攜帶線粒體m.4435A＞G和YARS2 c.5750A＞C突變的原發(fā)性高血壓家系圖

2.2 線粒體基因和YARS2基因測序分析 對家系所有成員線粒體及YARS2基因進(jìn)行擴(kuò)增和測序分析，并將測序結(jié)果與人類線粒體DNA標(biāo)準(zhǔn)劍橋序列（Genbank NC_012920）和YARS2基因標(biāo)準(zhǔn)序列（RefSeq NC_000012.12）對比分析，本次采集的母系成員的線粒體基因均攜帶m.4435A＞G突變（見圖2A），同時mtDNA序列還存在多種無功能意義的多態(tài)性位點(diǎn)；YARS2基因c.5750位點(diǎn)存在不同程度突變（見圖2B）。圖3所示為突變所在位置，4435突變位點(diǎn)位于線粒體tRNAMet反密碼子的第37位，在17個物種中的保守性為100%，其突變可能破壞線粒體tRNA的結(jié)構(gòu)和功能。

圖2 m.4435A＞G及YARS2 c.5750A＞C突變的鑒定

2.3 突變對線粒體tRNA穩(wěn)態(tài)水平的影響 m.4435A＞G突變破壞了tRNAMet5’接受臂上高度保守的A-U配對，可能影響tRNA的結(jié)構(gòu)和功能；核基因YARS2編碼線粒體酪氨酸-tRNA合成酶，在細(xì)胞質(zhì)中合成后轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，催化酪氨酸與相應(yīng)tRNA發(fā)生酯化反應(yīng)形成氨酰tRNA的酶，參與線粒體翻譯過程。為進(jìn)一步檢測m.4435A＞G突變對tRNAMet穩(wěn)態(tài)水平以及YARS2c.5750A＞C突變是否對線粒體突變具有加重作用，研究中每種突變各選取1個樣本，正常對照組選用2個樣本（CL1-2、C072為正常對照；NT719-P3僅攜帶m.4435A＞G突變；NT719-P2同時攜帶YARS2c.5750A＞C雜合及m.4435A＞G突變；NT719同時攜帶YARS2c.5750A＞C純合及m.4435A＞G突變），分別提取各樣本的線粒體RNA，并分別與地高辛標(biāo)記的線粒體tRNAMet、tRNATyr、tRNAGln、tRNAArg、tRNAHis和細(xì)胞的核基因編碼的5S RNA探針進(jìn)行了Northern blot雜交實驗，結(jié)果如圖4A所示，攜帶m.4435A＞G突變的樣本（NT719-P2、NT719-P3和NT719）tRNAMet穩(wěn)態(tài)水平明顯低于未突變樣本，分別為對照樣本的91.53%（P=0.1945）、61.08%（P=0.1152）和43.34%（P=0.0012）；攜帶YARS2c.5750A＞C突變的樣本（NT719-P2和NT719）tRNATyr穩(wěn)態(tài)水平亦明顯低于未突變樣本，分別為對照樣本的74.29%和72.1%；其他線粒體tRNAGln、tRNAArg、tRNAHis的穩(wěn)態(tài)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4B。2.4 突變對細(xì)胞ROS水平的影響 如圖5所示，與對照組比，所有母系成員的細(xì)胞株ROS水平均出現(xiàn)較大幅度的升高：m.4435A＞G單突變樣本（NT719-P3）、雙突變雜合組（NT719-P2）和雙突變純合組（NT719）分別是對照組的137.41%（P=0.0028）、127.84%（P=0.0434）、155.76%（P=0.0025）。

圖3 突變所在位置

圖4 Northern blot雜交實驗結(jié)果

2.5 突變對MMP水平的影響 用JC-10熒光探針檢測突變型與野生型的MMP變化。MMP的變化是由EX/Em=490/590和Ex/Em=490/530的平均熒光強(qiáng)度比值反應(yīng)，即FL590/FL530表示MMP水平。結(jié)果如圖6A所示：m.4435A＞G單突變樣本（NT719-P3）、雙突變雜合組（NT719-P2）和雙突變純合組（NT719）分別是對照組的78.96%（P=0.0096）、67.95%（P=0.0030）和59.13%（P=0.0017）。而經(jīng)解偶聯(lián)劑CCCP（羰基氰化物間氯苯腙）處理后，細(xì)胞膜對H+通透性大大提高，使膜兩側(cè)的質(zhì)子梯度消除，從而野生型和突變型細(xì)胞間的MMP沒有顯著差異，見圖6B。提示攜帶線粒體m.tRNAMet4435A＞G和突變影響線粒體去極化，導(dǎo)致MMP降低。

圖5 細(xì)胞ROS水平分析

圖6 MMP分析

3 討論

外周血淋巴細(xì)胞在體外壽命有限，而人類永生化淋巴母細(xì)胞系具有可以在體外進(jìn)行無限繁殖和生存的特性[14]，因此可以使人類珍貴的原發(fā)性高血壓家系遺傳資料得以永久保存[15]。本研究采用的方法為構(gòu)建各個突變細(xì)胞株以及野生型細(xì)胞株的永生化淋巴母細(xì)胞系，然后通過一系列研究比較野生型細(xì)胞系和攜帶m.4435A＞G突變和YARS2c.5750A＞C突變細(xì)胞功能上的差異，從而研究m.4435A＞G突變和YARS2c.5750A＞C突變與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性。

m.4435A＞G突變是一個已經(jīng)報道的可能與母系遺傳原發(fā)性高血壓相關(guān)的一個位點(diǎn)，該突變破壞了tRNAMet反密碼子環(huán)上高度保守的A-U配對，可能影響tRNA的結(jié)構(gòu)和功能[16]，引起線粒體整體翻譯水平下降，造成氧化磷酸化水平降低；核修飾基因YARS2c.5750A＞C突變是在中國母系遺傳性耳聾家系中發(fā)現(xiàn)的首個核修飾基因，核基因YARS2編碼線粒體酪氨酸-tRNA合成酶，在細(xì)胞質(zhì)中合成后轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，催化酪氨酸與相應(yīng)tRNA發(fā)生酯化反應(yīng)形成氨酰tRNA的酶，參與線粒體翻譯過程[17]，由此推測YARS2c.c.5750A＞C突變加重m.4435A＞G家系原發(fā)性高血壓表型的表達(dá)。

曾有報道顯示核基因突變與線粒體基因突變同時存在會導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生。GUAN等[5]于2006年首次報道核修飾基因TRMU 28A＞G純合突變與mtDNA1555A＞G純合突變同時存在時，會導(dǎo)致非綜合征性耳聾的發(fā)生，第一次將核基因與線粒體疾病聯(lián)系起來。同時Leigh綜合征中發(fā)現(xiàn)核基因和線粒體基因都存在突變，其中包括核基因的SURF1、PDHC等突變，這些基因都與線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性相關(guān)[18]。線粒體上的突變有：8993T＞G/C。而且mtDNA的合成、復(fù)制、修飾加工等過程以及與酶復(fù)合體組裝有關(guān)，許多蛋白質(zhì)的完整性受到核基因和mtDNA的雙重調(diào)控作用[19]。

本研究tRNA穩(wěn)態(tài)水平結(jié)果顯示，攜帶m.4435A＞G突變的樣本的tRNAMet穩(wěn)態(tài)水平明顯降低，且雙突變純合樣本的tRNAMet降低量要多于雙突變雜合樣本，該結(jié)果提示YARS2c.5750A＞C突變可能對m.4435A＞G突變導(dǎo)致的tRNAMet代謝異常具有加重作用。線粒體tRNA水平的異常會導(dǎo)致呼吸損傷，最終表現(xiàn)為細(xì)胞某些功能的異常，本研究結(jié)果表明攜帶m.4435A＞G單突變樣本的MMP降低量為21.04%，而雙突變樣本的MMP下降量為32.05%～40.87%。正常的MMP水平是維持線粒體進(jìn)行氧化磷酸化的必要條件，MMP的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件[20-21]，將會導(dǎo)致突變樣本的線粒體質(zhì)子電化學(xué)勢的下降，進(jìn)而導(dǎo)致更多的電子從電子傳遞鏈中泄露，由此引起ROS產(chǎn)量增加。本研究中m.4435A＞G單突變樣本ROS升高量為27.84%，而雙突變樣本的ROS升高量為37.41%～55.76%，提示YARS2c.5750A＞C突變對m.4435A＞G突變引起的ROS升高有加重的作用，進(jìn)一步明確了tRNAMet代謝異常在細(xì)胞呼吸缺陷產(chǎn)生的過程中發(fā)揮了重要作用。

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