歐少福，劉瑞連，首弟武

1.張家界市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 張家界 427000；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410005

冰荷洗劑是治療龜頭炎的經(jīng)驗(yàn)方，主要由苦參、黃柏、土茯苓、茵陳、龍膽、白蘚皮、冰片、薄荷等組成，具有清熱利濕、芳香化濁、殺蟲(chóng)止癢等功效[1]。冰荷洗劑外用治療龜頭炎療效高，使用方便、經(jīng)濟(jì)，總有效率達(dá)到90%，且無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)[2～4]。由于龜頭炎危害生殖系統(tǒng)健康，引發(fā)泌尿系統(tǒng)疾病，導(dǎo)致性功能障礙，造成不育癥等，故研究開(kāi)發(fā)出治療該病的有效藥物迫在眉睫。為了將該經(jīng)驗(yàn)方制成一個(gè)工藝先進(jìn)、制劑穩(wěn)定、療效確切的中成藥，在前期以化學(xué)成分為指標(biāo)優(yōu)選工藝的基礎(chǔ)上，以主要藥效作用和致敏性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選冰荷洗劑的制備工藝。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同工藝制備的冰荷洗劑進(jìn)行了小鼠耳腫脹模型的抗炎作用及對(duì)豚鼠致敏性的比較，為確定最佳工藝提供更為確切的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠50只，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：43004800035762。白色豚鼠60只，SPF級(jí)，體質(zhì)量250～300 g，雌雄各半，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：43004800036321。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 冰荷洗液：各工藝組由湖南中醫(yī)藥大學(xué)提供，具體制備工藝如下：①冰荷洗劑水提組：按處方稱取花椒、薄荷、茵陳、龍膽草、苦參、黃柏、白鮮皮、土茯苓、青蒿等飲片加7倍量水浸泡0.5 h后，先武火煮沸，再文火煮沸1 h，濾過(guò)，收集濾液，藥渣再加5倍量水煮沸40min，濾過(guò)，合并濾液，適當(dāng)濃縮；冰片細(xì)粉用5%無(wú)水乙醇溶解，加入濃縮液中，調(diào)整至每1mL藥液相當(dāng)于1 g生藥量，即得。②冰荷洗劑醇提組：稱取各藥物用60%乙醇回流提取，回收醇，溶媒用量、提取時(shí)間與藥液濃度同上。③部分水提部分醇提組：薄荷、花椒、龍膽草、茵陳同①水提，濃縮，備用；苦參、黃柏、白鮮皮、土茯苓、青蒿同②醇提；水提與醇提濃縮液合并，同上加冰片，即得。④提揮發(fā)油組：按處方稱取薄荷、花椒加8倍量水浸泡0.5 h后提取揮發(fā)油至油不再增加為止，收集揮發(fā)油，濾出藥液，藥渣均備用；其他藥物同③提取、制備藥液。

1.3 試劑與儀器 二甲苯(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20130528)；2，4-二硝基氯苯(北京西亞化學(xué)股份有限公司，批號(hào)：w5656)。AB204型電子天平(瑞士梅特勒)，耳打孔器(深圳瑞沃德)。

2 方法

2.1 二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)[5～7]取ICR小鼠50只，雌雄各半，用8%硫化鈉脫去脊柱兩側(cè)毛，每側(cè)面積2 cm×2 cm。24 h后將小鼠隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組、冰荷洗劑水提組、冰荷洗劑醇提組、冰荷洗劑部分水提部分醇提組、冰荷洗劑提揮發(fā)油組，每組10只，每天每只小鼠脫毛區(qū)涂藥1次，連續(xù)7天，空白對(duì)照組給予等體積蒸餾水。末次涂藥后30min，給小鼠右耳兩面涂以二甲苯0.02mL/只，15min后處死動(dòng)物，用8mm打孔器將小鼠雙耳等面積切下，用AB204型電子天平分別稱重，以左右二耳片重量差值作為腫脹度指標(biāo)，并計(jì)算抑制率。抑制率=[(右耳重量-左耳重量)/左耳重量]×100%。

2.2 皮膚致敏實(shí)驗(yàn)[8]取豚鼠60只，雌雄各半，用8%硫化鈉將豚鼠脊柱兩側(cè)毛脫掉，每側(cè)面積3 cm×3 cm。24 h后將豚鼠隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組、模型組、冰荷洗劑水提組、冰荷洗劑醇提組、冰荷洗劑部分水提部分醇提組、冰荷洗劑提揮發(fā)油組，每組10只。分別取冰荷洗劑水提物、冰荷洗劑醇提物、冰荷洗劑部分水提部分醇提物、冰荷洗劑提揮發(fā)油0.2mL涂在相應(yīng)組別動(dòng)物左側(cè)脫毛區(qū)，用一層油紙和二層紗布覆蓋，再以無(wú)刺激性膠布封閉、固定，持續(xù)6 h，第7天和第14天以同樣方法各重復(fù)1次?？瞻讓?duì)照組涂蒸餾水，模型組涂1%2，4-二硝基氯苯。于末次給冰荷洗劑水提物、冰荷洗劑醇提物、冰荷洗劑部分水提部分醇提物、冰荷洗劑提揮發(fā)油致敏后14天，涂1%2，4-二硝基氯苯，6 h后去掉受試物，即刻觀察，然后于24、48、72 h再次觀察皮膚過(guò)敏反應(yīng)情況，按表1記錄各時(shí)間過(guò)敏反應(yīng)分值，并計(jì)算動(dòng)物致敏發(fā)生率。致敏發(fā)生率=出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)/受試動(dòng)物總數(shù)×100%。致敏發(fā)生率1%～10%，提示藥物無(wú)致敏性；致敏發(fā)生率11%～30%，提示藥物有輕度致敏性；31%～60%，提示藥物有中度致敏性；61%～80%，提示藥物有重度致敏性；81%～100%，提示藥物有極度致敏性。2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(±s)表示，滿足正態(tài)性與方差齊性，采用單因素方差分析，不滿足滿足正態(tài)性與方差齊性，采用非參數(shù)法檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

表1 皮膚過(guò)敏反應(yīng)程度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠耳廓二甲苯致炎結(jié)果比較 見(jiàn)表2。與空白對(duì)照組比較，冰荷洗劑水提組、冰荷洗劑醇提組、冰荷洗劑部分水提部分醇提組及冰荷洗劑提揮發(fā)油組小鼠耳腫脹度均顯著降低，耳腫脹抑制率顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)果提示，冰荷洗劑水提、冰荷洗劑醇提、冰荷洗劑部分水提部分醇提及冰荷洗劑提揮發(fā)油具有明顯的抗炎消腫作用，且冰荷洗劑提揮發(fā)油作用要優(yōu)于其他工藝組。

表2 各組小鼠耳廓二甲苯致炎結(jié)果比較(±s)

表2 各組小鼠耳廓二甲苯致炎結(jié)果比較(±s)

與空白對(duì)照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組 別空白對(duì)照組冰荷洗劑水提組冰荷洗劑醇提組冰荷洗劑部分水提部分醇提組冰荷洗劑提揮發(fā)油組n 10 10 10 10 10腫脹度(mg)10.92±2.18 8.52± 1.95①8.37± 1.81②8.21± 1.89②7.59± 1.66②抑制率(%)0 21.8②23.4②24.8②30.5②

3.2 各組豚鼠皮膚致敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 見(jiàn)表3、表4。模型組的致敏率為100%，而冰荷洗劑水提組、冰荷洗劑醇提組、冰荷洗劑部分水提部分醇提組及冰荷洗劑提揮發(fā)油組致敏率均為0。與空白對(duì)照組比較，模型組豚鼠致敏率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，冰荷洗劑水提組、冰荷洗劑醇提組、冰荷洗劑部分水提部分醇提組及冰荷洗劑提揮發(fā)油組

豚鼠致敏率較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)果提示，冰荷洗劑水提、冰荷洗劑醇提、冰荷洗劑部分水提部分醇提及冰荷洗劑提揮發(fā)油均對(duì)豚鼠無(wú)致敏性。

表3 冰荷洗劑致皮膚過(guò)敏反應(yīng)情況例

（續(xù)表 3）

表4 冰荷洗劑致皮膚過(guò)敏發(fā)生率結(jié)果比較 %

4 討論

龜頭炎為男科臨床常見(jiàn)病，其病因多與包皮垢、尿液、堿性物質(zhì)和外來(lái)刺激、摩擦、創(chuàng)傷，或包皮過(guò)長(zhǎng)未能經(jīng)常清洗，以及不潔性接觸史等密切相關(guān)，亦可由細(xì)菌、真菌感染或藥物過(guò)敏引起[9]。龜頭炎危害生殖系統(tǒng)健康，引發(fā)泌尿系統(tǒng)疾病，導(dǎo)致性功能障礙，造成不育癥等，故亟待研究開(kāi)發(fā)出治療該病的療效確切藥物。

二甲苯致小鼠耳廓腫脹是經(jīng)典的急性炎癥藥效評(píng)價(jià)模型，其致炎機(jī)制主要是以二甲苯為致炎劑，誘導(dǎo)組胺、激肽及纖維蛋白溶解酶等炎癥介質(zhì)釋放，引起局部毛細(xì)血管通透性的增加、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、急性滲出性炎性水腫，從而模擬人類的炎癥病理性特征[10]。研究結(jié)果顯示，冰荷洗劑水提、冰荷洗劑醇提、冰荷洗劑部分水提部分醇提及冰荷洗劑提揮發(fā)油均能不同程度抑制二甲苯致小鼠耳廓腫脹，升高耳腫脹抑制率。結(jié)果提示，不同制備工藝的冰荷洗劑均具有明顯的抗炎作用，其作用機(jī)制可能與抑制組胺、激肽及纖維蛋白溶解酶等炎癥介質(zhì)的大量釋放有關(guān)。本研究顯示，冰荷洗劑提揮發(fā)油的抗炎作用優(yōu)于其他工藝組，可能與揮發(fā)油的透皮吸收效率有關(guān)，其確切的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

皮膚過(guò)敏性評(píng)價(jià)是外用制劑的常用安全性評(píng)價(jià)指標(biāo)。藥物及藥用輔料均可能成為致敏原，誘發(fā)皮膚局部過(guò)敏性反應(yīng)，嚴(yán)重者引起全身性過(guò)敏反應(yīng)，造成使用者傷亡[11]。2，4-二硝基氯代苯為國(guó)際公認(rèn)的極強(qiáng)致敏劑，2，4-二硝基氯代苯致豚鼠皮膚過(guò)敏試驗(yàn)是經(jīng)典的皮膚過(guò)敏性評(píng)價(jià)模型。本研究結(jié)果顯示，冰荷洗劑水提組、冰荷洗劑醇提組、冰荷洗劑部分水提部分醇提組及冰荷洗劑提揮發(fā)油組致敏率均為0，提示各制備工藝所制備的冰荷洗劑均對(duì)豚鼠無(wú)致敏性，即各制備工藝所制備的冰荷洗劑臨床使用是安全的。

[1] 劉瑞連，嚴(yán)建業(yè)，李順祥，等．正交試驗(yàn)法優(yōu)選冰荷洗劑醇提工藝[J]．湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32(9)：33-36．

[2] 劉穎．冰荷合劑治療念珠菌性龜頭炎療效護(hù)理觀察[J]．中國(guó)性科學(xué)，2010，19(9)：21-23．

[3] 譚育紅，朱湘生，尹春輝，等．冰荷合劑治療濕熱證龜頭炎臨床觀察[J]．中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，5(11)：110-111.

[4] 朱湘生，譚育紅，劉穎，等．冰荷合劑治療念珠菌性龜頭炎30例臨床觀察[J]．中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2007，13(11)：34-36.

[5] 謝麗莎，蒙田秀，歐陽(yáng)煒，等．千年健鎮(zhèn)痛抗炎藥理研究[J]．寧夏農(nóng)林科技，2012，53(9)：159-160．

[6] 張興燊，周芳，廖月葵，等．古鉤藤鎮(zhèn)痛抗炎藥理作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18(7)：1603-1604.

[7] 趙勤，胡銳，葛明娟，等．大秦艽湯抗炎作用研究[J]．中藥藥理與臨床，2012，28(3)：21-22．

[8] 滕志敏，趙杰．復(fù)方苦參膏對(duì)皮膚刺激性和致敏性的實(shí)驗(yàn)研究[J]．中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2008，17(9)：47-48．

[9] Pulido-Perez A，Suarez-Fernandez R．Circinate Balanitis[J].N Engl JMed，2017，376(2)：157．

[10] 谷捷，李鑫，余黃合，等．二甲苯致小鼠耳腫脹急性炎癥模型的建立[J]．湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，36(5)：32-35．

[11] Lockey RF，Teng MN． Human passive cutaneous anaphylaxis in the 21st century：Worth the risk?[J]． JAllergy Clin Immunol，2017，139(6)：1795-1796．