錢丹，韋力，鄭梓培，黃向紅

1.廣州市越秀區(qū)兒童醫(yī)院，廣東 廣州 510110；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

上呼吸道感染(以下簡(jiǎn)稱上感)雖然是一種自限性疾病，但由于兒童的體質(zhì)特點(diǎn)，容易引起上感反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響兒童的生長(zhǎng)發(fā)育甚至生活，因此防治工作尤為重要。筆者前期進(jìn)行了小樣本的臨床試驗(yàn)，觀察防感香佩包對(duì)兒童上感反復(fù)發(fā)作的預(yù)防作用，取得良好療效[1]。后通過(guò)擴(kuò)大樣本量，設(shè)立多層次立體觀察指標(biāo)，分析防治兒童上感反復(fù)發(fā)作情況，防感香佩包能夠明顯降低兒童上感發(fā)作次數(shù)，縮短發(fā)作病程[2]。防感香佩包為佩戴使用，藥效的發(fā)揮很可能與其所含揮發(fā)性成分通過(guò)呼吸吸入產(chǎn)生作用，為解釋其臨床療效的可能作用機(jī)理，對(duì)防感香佩包中揮發(fā)油成分進(jìn)行提取分離，深入探索其化學(xué)成分與臨床療效的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 藥物與器材 防感香佩包(廣東源生泰藥業(yè)有限公司制備)；7890B氣相色譜儀；5977A型質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)；AgilentMassHunter Qualitatve Analysis B07.00數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)；HP-5ms Ulira Inert毛細(xì)管柱(30m×250μm× 0.25μm)。

1.2 揮發(fā)油提取分離 準(zhǔn)確稱取37包防感香佩包，置于燒瓶中，加入10倍量水與適量沸石，參照藥典附錄XD揮發(fā)油測(cè)定法連接揮發(fā)油提取器和冷凝管，定量加水至提取器。以提取揮發(fā)油出油率高低為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)浸泡時(shí)間(1、2、3、4 h)、提取時(shí)間(1、2、3、4、5 h)、料液比(5、10、20、30 倍)及提取次數(shù)(1、2、3次)進(jìn)行考察，確定高出油率的提取分離條件。1.3 揮發(fā)油成分分析 GC-MS條件：色譜條件：進(jìn)樣口溫度250℃；載氣流速1mL/min；程序升溫：起始柱溫60℃，以5℃/min升溫至120℃，再以1℃/min升溫至160℃，保持1 min，最后以15℃/min升溫至200℃；分流比為60∶1；進(jìn)樣量為1μL；載氣為高純氦氣(99.99%)。

質(zhì)譜條件：EI電離；離子源溫度為230℃；四級(jí)桿溫度：150℃：電子轟擊能量70 eV；接口溫度280℃；掃描模式m/z，掃描范圍50～550；溶劑延遲3min。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(±s)表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 浸泡時(shí)間確定 見(jiàn)表1。準(zhǔn)確稱取37包樣品，置于燒瓶中，加入10倍量水與適量沸石，參照藥典附錄XD連接揮發(fā)油提取器和冷凝管，定量加水至提取器，保持微沸3 h，記錄揮發(fā)油體積，計(jì)算出油率，出油率=(出油量/樣品重量)×100%，浸泡1 h出油率較高。

表1 浸泡時(shí)間對(duì)出油率的影響

2.2 提取時(shí)間確定 見(jiàn)表2。準(zhǔn)確稱取37包樣品，置于燒瓶中，加入10倍量水與適量沸石，參照藥典附錄XD連接揮發(fā)油提取器和冷凝管，定量加水至提取器，保持微沸，記錄揮發(fā)油體積，計(jì)算出油率，出油率=(出油量/樣品重量)×100%，綜合考慮能量損耗，確定提取時(shí)間為3 h。

2.3 料液比的確定 見(jiàn)表3。準(zhǔn)確稱取37包樣品，置于燒瓶中，加入5、10、20、30倍量水與適量沸石，參照藥典附錄XD連接揮發(fā)油提取器和冷凝管，定量加水至提取器，定量加入環(huán)己烷，浸泡1 h，保持微沸3 h，記錄揮發(fā)油體積，計(jì)算出油率，出油率=(出油量/樣品重量)×100%，液比為1∶5時(shí)，出油率最高。

表2 提取時(shí)間對(duì)出油率的影響

表3 料液比對(duì)出油率的影響

2.4 提取次數(shù)的確定 見(jiàn)表4。準(zhǔn)確稱取37包樣品，置于燒瓶中，加入5倍量水與適量沸石，參照藥典附錄XD連接揮發(fā)油提取器和冷凝管，定量加水至提取器，定量加入環(huán)己烷，浸泡1 h，保持微沸3 h，分別提取1、2、3次，記錄揮發(fā)油體積，計(jì)算出油率，出油率=(出油量/樣品重量)×100%，提取3次樣品中揮發(fā)油基本提取完全。

表4 提取次數(shù)對(duì)出油率的影響

2.5 防感香佩包揮發(fā)油化學(xué)成分分析 見(jiàn)圖1。根據(jù)出峰(保留時(shí)間)RT和豐度及峰面積等，經(jīng)GC-MS對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行成分分析，匹配揮發(fā)油成分質(zhì)譜譜庫(kù)，發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油中主要成分為倍半萜類(50%)和細(xì)辛醚類(43%)。

3 討論

前期小樣本臨床試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，防感香佩包對(duì)兒童上感反復(fù)發(fā)作具有一定預(yù)防作用[1]，根據(jù)防感香佩包所含中藥初步推測(cè)其作用機(jī)制為通過(guò)殺滅細(xì)菌或病毒，提高人體免疫力為主。因防感香佩包為佩戴使用，經(jīng)呼吸進(jìn)行給藥，非口服給藥，其療效的發(fā)揮很可能與所含揮發(fā)油成分具有很大相關(guān)性。因此本研究通過(guò)提取分離收集揮發(fā)油，分析揮發(fā)油中主要有效成分，探索防感香佩包可能的作用機(jī)制。

通過(guò)考察防感香佩包中揮發(fā)油提取分離條件，出油率并非隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)而有所增加，說(shuō)明經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的浸泡，水溶性成分可以得到很好的溶出，但同時(shí)伴隨著揮發(fā)性成分的損耗，提示在收集揮發(fā)油成分時(shí)，浸泡時(shí)間并非如收集水溶性成分那樣呈現(xiàn)線性關(guān)系，而表現(xiàn)出類似于正態(tài)分布的情況。出油率雖隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加[3]，但在提取3～4 h時(shí)，進(jìn)入小的平臺(tái)期，綜合能量損耗考慮，最終確定3 h的提取時(shí)間。關(guān)于料液比的選擇，隨著浸泡水量的增加，出油率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，提示在收集揮發(fā)性成分時(shí)，料液比要控制在較低比例，一方面可以避免揮發(fā)油損耗，另一方面可以降低能耗，提高提取效率。關(guān)于提取次數(shù)，隨著提取次數(shù)的增加，出油率呈線性上升趨勢(shì)，提示充分的煎煮冷凝回流能夠提高出油率。以上關(guān)于防感香佩包揮發(fā)油部位的提取分離條件可為其他復(fù)方中揮發(fā)油的提取提供借鑒參考。

前期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，佩戴防感香佩包的易感兒童，在發(fā)作次數(shù)、發(fā)作時(shí)間及時(shí)間間隔上都明顯優(yōu)于對(duì)照組，明顯降低發(fā)作次數(shù)，并能夠減少發(fā)病的持續(xù)時(shí)間，說(shuō)明防感香佩包對(duì)兒童上感反復(fù)發(fā)作的防治療效確切[2]。有研究對(duì)兒童上感反復(fù)發(fā)作的多種致病因素進(jìn)行分析，均指向免疫力低下[4]。也有研究發(fā)現(xiàn)兒童上感的反復(fù)發(fā)作和兒童的體質(zhì)有很大相關(guān)性[5]。說(shuō)明免疫力低下的兒童，上感的易感性越強(qiáng)，反復(fù)發(fā)作次數(shù)愈多。佩戴防感香佩包能夠減少發(fā)作次數(shù)，提示在提高兒童免疫力、增強(qiáng)體質(zhì)方面有一定作用，方中主要含有的石菖蒲具有芳香辟穢、醒脾開(kāi)竅的功效。石菖蒲揮發(fā)油中主要化學(xué)成分為細(xì)辛醚類，藥理學(xué)研究表明，細(xì)辛醚能夠提高氣管平滑肌的抗過(guò)敏能力，對(duì)細(xì)胞損傷具有一定程度的保護(hù)作用[6]，對(duì)呼吸系統(tǒng)具有保護(hù)作用[7]，提高易感兒童對(duì)上感反復(fù)發(fā)作的抗病能力。本研究收集獲得的細(xì)辛醚類占比高達(dá)43%，表明細(xì)辛醚在降低兒童上感反復(fù)發(fā)作次數(shù)方面具有明顯藥理作用。即使易感兒童上感發(fā)作，防感香佩包能夠縮短病程，本研究獲得揮發(fā)性成分中，倍半萜類占比約50%，具有較強(qiáng)的抑制病毒和抗菌的作用[8]，其為薄荷油主要揮發(fā)性成分之一，同時(shí)白芷中的揮發(fā)性成分也具有抗過(guò)敏、抗炎平喘作用[9]，細(xì)辛醚類也發(fā)揮著抑制氣管平滑肌收縮和平喘的作用[10]，在共同作用下加快患兒發(fā)病期間的康復(fù)。

本研究通過(guò)提取分離收集揮發(fā)油中主要成分為倍半萜類(50%)和細(xì)辛醚類(43%)，對(duì)兒童上感反復(fù)發(fā)作的防治起到了關(guān)鍵作用。鼻腔為呼吸抵抗細(xì)菌和病毒的第一道防線，通過(guò)佩戴防感香佩包，細(xì)辛醚類通過(guò)呼吸經(jīng)鼻腔吸收，通過(guò)鼻黏膜血管吸收和嗅黏膜途徑可以直達(dá)腦組織[11]，具有一定腦靶向性，快速發(fā)揮其藥效。中醫(yī)認(rèn)為石菖蒲具有開(kāi)竅醒神的功效，提到的“竅”即為腦，這與中醫(yī)傳統(tǒng)的實(shí)踐認(rèn)知相一致。另外細(xì)菌和病毒易吸附在氣道黏膜上，損傷黏膜上皮，降低呼吸道黏膜的防御能力[4]，引起兒童上感反復(fù)發(fā)作。通過(guò)在體和體外實(shí)驗(yàn)研究表明，細(xì)辛醚能夠松弛氣管平滑肌，延長(zhǎng)哮喘發(fā)作，并能夠促進(jìn)氣管纖毛的運(yùn)動(dòng)[12]。倍半萜具有一定的殺菌作用，對(duì)抗原基因有明顯抑制作用，同時(shí)不影響人體正常細(xì)胞[13]，與中醫(yī)理論“驅(qū)邪不傷正”的認(rèn)知不謀而合。因此，防感香佩包用于防治兒童上感反復(fù)發(fā)作，其作用機(jī)理可能與所含揮發(fā)性成分細(xì)辛醚類和倍半萜類對(duì)上呼吸道的黏膜保護(hù)與抗病作用有關(guān)。

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