王 艷，段志強，韓志強

(1. 內(nèi)蒙古巴彥淖爾市醫(yī)院，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000；2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

蛛網(wǎng)膜下腔阻滯作為一種臨床常用麻醉方式，其具有麻藥用量小、麻醉效果好、神經(jīng)阻滯完善、血流動力學(xué)相對平穩(wěn)、麻醉起效快等優(yōu)點。鹽酸羅哌卡因是長效酰胺類局麻藥物代表，其具有將感覺和運動分離的阻滯效能,對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性較其他局麻藥小，且術(shù)后恢復(fù)較快，在臨床麻醉中頗受歡迎[1-5]。然而不同比重羅哌卡因脊麻對循環(huán) 、運動和脊神經(jīng)的影響仍有爭議，因此迫切需要找到一種合適的配伍方案，來平衡鹽酸羅哌卡因在腰麻中的麻醉效果與安全性。本實驗觀察比較了等比重鹽酸羅哌卡因和由5%及10%葡萄糖液配制而成的鹽酸羅哌卡因脊麻對家兔心率、平均動脈壓、后肢運動以及脊神經(jīng)的影響，旨在尋找蛛網(wǎng)膜下腔阻滯中合適的局麻藥配伍，為臨床平衡麻醉安全性與阻滯完善性提供參考依據(jù)。

1 實驗資料

1.1實驗動物及分組 健康成年家兔30只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證號：44005900002150。將家兔隨機分為CR組、5GR組、10GR組，每組10只。

1.2實驗方法

1.2.1蛛網(wǎng)膜下腔穿刺 將家兔以俯臥位固定于動物手術(shù)臺上,用20 g/L戊巴比妥鈉按30 mg/kg從兔耳緣靜脈注射，待家兔麻醉后，采用動物心電監(jiān)測儀(邁新電子公司)監(jiān)測血壓和心率，并將其放置為左側(cè)臥位，保持頭高腳低20°，盡量使其尾向腹側(cè)屈曲以更好地暴露間隙。找到第7腰椎，并用動物專用手術(shù)器械(北京圣龍恒宇有限公司)將其周圍的毛剪掉，用碘伏消毒，找到L6—7間隙，逐層將家兔背部皮膚切開，解剖清楚后，使用硬膜外穿刺針(河南駝人醫(yī)療器件集團(tuán)有限公司)在L6—7間隙進(jìn)行穿刺，當(dāng)有突破感后，拔出硬膜外針的針芯，用腰麻針(河南駝人醫(yī)療器件集團(tuán)有限公司)進(jìn)行蛛網(wǎng)膜下腔穿刺，如若觀察到家兔后肢跳動，拔出腰麻針針芯，見有少量腦脊液流出，可視為蛛網(wǎng)膜下腔穿刺成功。

1.2.2蛛網(wǎng)膜下腔給藥 分別于20 s內(nèi)向蛛網(wǎng)膜下腔注入藥物：CR組給予由1%鹽酸羅哌卡因(阿斯利康)和腦脊液各0.1 mL混合配制成的等比重羅哌卡因；5GR組給予由1%鹽酸羅哌卡因和5%葡萄糖液各0.1 mL混合配制成的重比重羅哌卡因；10GR組給予由1%鹽酸羅哌卡因和10%葡萄糖液各0.1 mL混合配制成的重比重羅哌卡因。所有的注藥操作均由同一人來完成，并保證注藥速度為0.1 mL/10 s。實驗過程中若出現(xiàn)全脊麻現(xiàn)象，則該動物被剔除實驗。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1心率和平均動脈壓 記錄給藥前5 min、給藥后30 s、給藥后30 min、給藥后6 h心率和平均動脈壓。

1.3.2后肢運動阻滯情況 按照4分視覺模擬評分法[6]記錄給藥前5 min及給藥后30 s、30 min、1 h、6 h運動阻滯情況。0分： 雙后肢自由活動；1分： 肢體步行不對稱或受限；2分：雙后肢不能支撐身體；3分：雙后肢完全麻痹。記錄每只家兔后肢運動阻滯的顯效時間和持續(xù)時間，其中顯效時間指從蛛網(wǎng)膜下腔注射給藥完成開始計時到家兔后肢運動神經(jīng)阻滯程度達(dá)到最佳所用時間，維持時間指從蛛網(wǎng)膜下腔注射給藥完成開始計時到家兔后肢運動神經(jīng)阻滯完全恢復(fù)所用的時間。

1.3.3Bax和Bcl-2表達(dá)情況 給藥6 h后，肌注鹽酸氯胺酮 (正康醫(yī)藥化工有限公司)30 mg/kg或者咪唑安定(恩華藥業(yè)股份有限公司)5 mg麻醉家兔，仰臥位固定于動物手術(shù)臺上,備皮、消毒，從家兔胸骨左緣逐層切開,暴露心臟,用12號針( 河北衡水鼎杰商貿(mào)有限公司)分別刺入家兔左心室和右心房并將其固定，然后從家兔左心室快速注入生理鹽水500 mL,同時從右心房抽血，之后再從靜脈快速注入40 g/L的多聚甲醛(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)實驗中心)1 000 mL,用清水沖洗干凈后放到白色大托盤中，解剖家兔的脊柱, 并將分離出的脊髓用40 g/L的多聚甲醛溶液進(jìn)行固定。最后取家兔脊髓的不同節(jié)段進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，做連續(xù)切片，切片的厚度為4 μm。將切片經(jīng)常規(guī)脫蠟和水化后完成熱抗原修復(fù)過程，再用自來水沖洗1 min，并將玻片上待測組織區(qū)域用油筆圈定，之后用PBS 溶液沖洗(武漢博士德生物工程有限公司)3 min，共3次，除去PBS液，在油筆標(biāo)定區(qū)域內(nèi)加100 μL內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育10 min。完成加抗體、加反應(yīng)增強液、加酶標(biāo)抗兔IgG聚合物等步驟，最后加150 μL新鮮配制的DAB顯色液(武漢博士德生物工程有限公司)，室溫下孵育3～5 min，用自來水沖洗，用150 μL蘇木紫輕度復(fù)染，脫水，透明封片。 隨機選取每只動物的脊髓片3張，使用高倍鏡(Olympus FV500)、以Nikon相機在脊髓灰質(zhì)背角截取一屏，之后采用Image-Pro Plus 5.1圖像分析軟件(Olympus FV500)計算Bax和Bcl-2并分析其表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.13組家兔各時間點心率、平均動脈壓比較 CR組各時間點心率和血壓比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；5GR組各時間點血壓比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，心率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；10GR組各時間點心率和血壓比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

2.23組家兔各時間點后肢運動評分情況比較給藥前5 min，3組家兔后肢運動評分均為0分。給藥30 s后，CR組后肢運動評分1分7只，2分1只，3分2只；5GR組2分5只，3分5只；10GR組2分2只，3分8只。給藥30 min后，3組家兔后肢運動評分均為10分。給藥1 h后，CR組后肢運動評分0分9只，1分1只；5GR組0分4只，1分6只；10GR組0分2只，1分8只。給藥6 h后，3組家兔后肢運動評分均為0分。給藥1 h后，CR組家兔后肢運動阻滯陽性率為10%(1/10)，5GR組為60%(6/10)，10GR組為80%(8/10)，10GR組阻滯陽性率明顯高于CR組和5GR組(P均<0.05)，5GR組明顯高于CR組(P<0.05)。

表1 3組各時間點心率、平均動脈壓比較

注：①與給藥前5 min比較，P<0.05；1 mmHg=0.133 kPa。

2.33組家兔給藥后后肢運動阻滯顯效時間、維持時間比較 5GR組和10GR組的顯效時間均明顯短于CR組(P均<0.05)，維持時間明顯長于CR組(P均<0.05)；10GR組顯效時間明顯短于5GR組(P<0.05)，維持時間明顯長于5GR組(P<0.05)。見表2。

2.43組家兔脊髓組織中Bax、Bcl-2表達(dá)情況比較 給藥6 h后，3組組織切片均有陽性細(xì)胞分布，其中10GR組Bax、Bcl-2表達(dá)水平均明顯高于CR組和5GR組(P均<0.05)，5GR組和CR組Bax、Bcl-2表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1、圖2及表3。

表2 3組給藥后后肢運動阻滯顯效時間、維持時間比較

注：①與CR組比較，P<0.05；②與5GR組比較，P<0.05。

3 討 論

既往研究發(fā)現(xiàn)，在蛛網(wǎng)膜下腔注入等比重羅哌卡因，心率和平均動脈壓下降幅度較大，而注入重比重羅哌卡因,循環(huán)的穩(wěn)定性相對較好，這對心血管功能差的患者而言更為有利[7]。本實驗結(jié)果顯示，10GR組各時間點心率和血壓比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；5GR組各時間點血壓比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，心率有統(tǒng)計學(xué)意義；CR組各時間點心率和血壓比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。說明采取頭高足低體位給家兔實施蛛網(wǎng)膜下腔阻滯時，由10%葡萄糖液或者5%葡萄糖液配制的羅哌卡因?qū)ρh(huán)的穩(wěn)定性更為有利。究其原因，由于實驗中所有家兔均采用頭高足低體位，注入的重比重鹽酸羅哌卡因會受重力作用的影響易向家兔尾側(cè)擴(kuò)散，從而使麻醉平面不會因為太高產(chǎn)生較大的循環(huán)波動，但向家兔蛛網(wǎng)膜下腔注入等比重鹽酸羅哌卡因時，由于其不受重力作用的影響，所以在相同的注入容積和速度下，其擴(kuò)散平面相對較高，從而產(chǎn)生較大的循環(huán)波動，這與既往研究結(jié)論一致。

CR組 5GR組 10GR組

CR組 5GR組 10GR組

組別nBaxBcl-2Bax/Bcl-2CR組10192.60±36.90①182.50±28.37①1.08±0.325GR組10190.40±36.07①181.40±26.45①1.08±0.3510GR組10280.40±21.06285.50±11.400.98±0.06

注：①與10GR組比較，P<0.05。

鹽酸羅哌卡因?qū)\動神經(jīng)的鞘膜以及血腦屏障的穿透能力和蓄積能力相對較差，而對A和C神經(jīng)纖維的阻滯作用相對較強，這可能與其血漿蛋白結(jié)合率和脂溶性較低有關(guān)，這被認(rèn)為是其可產(chǎn)生感覺運動神經(jīng)分離阻滯的藥理學(xué)基礎(chǔ)。Anitha等[8]報道單純使用羅哌卡因?qū)\動神經(jīng)的阻滯能力較弱，但將其與葡萄糖配伍時對運動神經(jīng)阻滯的能力則會增強。本實驗中，給藥后30 s， CR組有3只家兔后肢運動評分在2分以上，而5GR組和10GR組評分均在2分以上，其中5GR組有5只、10GR組有8只評分為3分；給藥后1h，CR組有9只、5GR組有4只、10GR組有2只評分為1分。這說明羅哌卡因與葡萄糖液混合配伍用于蛛網(wǎng)膜下腔阻滯較其與腦脊液混合對運動神經(jīng)阻滯速度快，持續(xù)時間長，且與10%葡萄糖液混合較與5%葡萄糖液混合這一作用更明顯，與文獻(xiàn)[8]研究結(jié)果相符合。

神經(jīng)元暴露于高糖狀態(tài)下會產(chǎn)生顯著的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使細(xì)胞發(fā)生凋亡[8-10]；且細(xì)胞半胱氨酸酶的活性能夠在高糖環(huán)境中被激活，使得乳酸脫氫酶發(fā)生滲漏，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞毒性增加[11]。Russell等[12]發(fā)現(xiàn)將背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(DRGn)放置于濃度為10～45 mmol/L的葡萄糖中24 h，Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào),凋亡細(xì)胞數(shù)量增加；孫青等[9]在和鄭良杰等[13]研究發(fā)現(xiàn)高滲糖溶液可以誘發(fā)大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，引起受試大鼠發(fā)生神經(jīng)纖維脫髓鞘病變，最終引發(fā)神經(jīng)損傷，并且其損傷程度與葡萄糖濃度呈正相關(guān)。目前研究顯示Bax和Bcl-2基因與凋亡的調(diào)控關(guān)系非常密切。Bcl-2屬于抑制生物體細(xì)胞凋亡的基因之一，可以使線粒體內(nèi)cyt-c的釋放減少，進(jìn)而使得Caspase的活化在一定程度上受到阻礙，同時Bcl-2能夠減少脂質(zhì)過氧化物以及氧自由基的產(chǎn)生，從而使細(xì)胞凋亡最后的共同通路因此而受到影響[14]。而Bax和Bcl-2的作用正好相反，該基因在對Bcl-2抑凋亡產(chǎn)生拮抗作用的同時，還能夠直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bax和Bcl-2可以通過形成同源或者異源二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡：當(dāng)Bax形成同源二聚體時對細(xì)胞凋亡起到促進(jìn)作用，而當(dāng)Bax與Bcl-2形成異源二聚體時則對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制作用。當(dāng)生物體細(xì)胞中Bcl-2/Bax的比值大于50%時,說明該細(xì)胞能夠耐受凋亡;而當(dāng)生物體細(xì)胞內(nèi)Bax的同源二聚體高達(dá)80%時,該細(xì)胞則傾向于出現(xiàn)凋亡[15]。因此，細(xì)胞中這一比值在醫(yī)學(xué)界常常被人們稱作為啟動凋亡程序的“分子開關(guān)”，因為它與存在于生物體的線粒體外膜上的各種離子通道的開放程度直接相關(guān),在外界因素刺激下,生物體細(xì)胞的生與死，最終取決于Bcl-2和Bax的調(diào)控結(jié)果[16]。本實驗結(jié)果顯示，給藥后6 h，10GR組的Bcl-2、Bax表達(dá)水平均明顯高于5GR組和CR組，但是3組Bcl-2/Bax比值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，因此認(rèn)為10%葡萄糖液與鹽酸羅哌卡因混合用于家兔蛛網(wǎng)膜下腔阻滯時神經(jīng)毒性大，但在給藥后6 h內(nèi)仍屬于可逆性損傷。

綜上所述，由10%葡萄糖液和5%葡萄糖液配制的重比重鹽酸羅哌卡因用于家兔蛛網(wǎng)膜下腔阻滯具有血流動力學(xué)穩(wěn)定的優(yōu)勢，對后肢運動神經(jīng)的阻滯作用起效更快、持續(xù)時間更長，且10%葡萄糖液配制的羅哌卡因效果更好，但神經(jīng)毒性明顯，該毒性損傷在給藥6h內(nèi)可逆。

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