王建彬，李雪萍，曾維英，程 慶，賴嘉希，陳惠茹，柯吳堅(jiān)

(1.汕頭市皮膚性病防治院，廣東汕頭 515041；2.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣州 510009)

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是全球最常見和最易感的性傳播感染[1，2]。性接觸是HPV主要的傳播方式，而間接接觸引起的HPV感染近年來逐漸引起重視[3]。Hernandez等[4]為研究HPV是否會(huì)通過手-性器官接觸傳播，他們通過隨訪25對(duì)HPV感染的夫婦發(fā)現(xiàn)，引起肛門生殖器部位疾病的HPV還可以通過手-生殖器的接觸感染性伴，提示手-性器官的接觸可能在HPV感染中發(fā)揮作用。Winer等[5，6]對(duì)女大學(xué)生進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，性活躍女生指尖HPV感染率為14%，如果僅有手-性器官接觸而沒有插入性行為女生指尖HPV感染率為10%，而沒有任何性接觸女生指尖HPV陽性率僅為1%，該研究進(jìn)一步提示手-性器官接觸在HPV感染中發(fā)揮作用。我們通過對(duì)國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，目前缺乏尖銳濕疣(condylomata acuminata，CA)患者指尖HPV感染數(shù)據(jù)。為此我們通過招募性病門診確診為CA的患者，采用PCR方法檢測(cè)其指尖HPV感染情況，來明確CA患者手指尖HPV感染情況及其在HPV傳播中的意義。

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象和樣本采集 入組CA患者診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)2000年衛(wèi)生部性病專家咨詢委員會(huì)制定的“性病診療規(guī)范和性病治療推薦方案” 并簽署知情同意書?；颊邽?014年2月～2015年12月期間來汕頭市皮膚性病防治院性病門診和南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院就診者。119例患者中男性57例，女性為62例。年齡18～64歲，平均年齡33.4歲。病程1～18個(gè)月，平均4.8個(gè)月。ACW排除標(biāo)準(zhǔn)：已經(jīng)接受治療的CA患者、HIV感染者、免疫功能低下者、長(zhǎng)期系統(tǒng)服用免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素、并發(fā)其他系統(tǒng)疾病和性傳播疾病者或無法隨訪者。囑患者避免洗手超過4 h后，用細(xì)胞刷于患者十指指尖處反復(fù)10次刷取上皮細(xì)胞，將其放入有患者編號(hào)的取樣管中，取樣管內(nèi)已加有專門細(xì)胞保存液，擰緊瓶蓋。標(biāo)本采集后立即送檢。4℃保存不超過24 h，-20℃保存不超過3個(gè)月。標(biāo)本運(yùn)送采用低溫保存運(yùn)送。

1.2 試劑與儀器 細(xì)胞裂解液(HybriBio公司)，Go Taq Buffer(Promega公司)，dNTP(Thermo公司)，MgCl2(Sigma公司)，Go Taq Polymerase(Promega公司)，分子水(Sigma公司)，瓊脂糖(Sigma公司)，PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad公司)。

1.3 方法 參照細(xì)胞裂解液(HybriBio)試劑操作說明提取DNA，具體方法如下：取500 μl臨床樣本14 000 r/min離心1 min，去上清。加入400 μl溶液I(事先45℃水浴中預(yù)熱)，振蕩混勻，100℃加熱15 min，室溫下放置2 min。點(diǎn)動(dòng)離心，加入400 μl溶液Ⅱ，振蕩混勻后，室溫下放置2 min，14 000 r/min離心5 min。去上清，重復(fù)2次(務(wù)必去干凈，或可將上清倒入廢液缸后，14 000 r/min離心1 min，用200 μl移液器調(diào)至90 μl量，輕輕將剩余上清吸盡，槍頭切勿碰到離心沉淀方向，以免吸掉DNA)。室溫放置2 min，加入60 μl溶液Ⅲ，充分溶解。靜置10 min，14 000 r/min離心1 min。取1～2 μl加入無菌水稀釋至合適體積，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260nm/A280nm值。如果核酸溶液A260 nm/A280 nm比值在1.8左右(范圍介于1.7～2.0)時(shí)，認(rèn)為已達(dá)到所要求的純度，將提取好的DNA置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。PCR檢測(cè)采用HPV通用引物MY09/11(MY09：5’-CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC-3’；MY11：5’-GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG-3’；M：A/C；R：A/G；W：A/T；Y：C/T)，引物由上海生物科技有限公司合成并經(jīng)PAGE純化。擴(kuò)增HPV L1片段產(chǎn)物大小為450 bp。PCR反應(yīng)總體系包含HPV模板DNA，上下游引物，Go Taq Buffer(Promega)，dNTP(Thermo)，MgCl2(Sigma)，Go Taq Polymerase(Promega)和分子水(Sigma)。PCR反應(yīng)條件：95℃加熱2 min后進(jìn)入40個(gè)循環(huán)。循環(huán)條件為95℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min。最后72℃延伸10 min。產(chǎn)物鑒定：1.5 g/dl瓊脂糖(Sigma)凝膠70V電泳40 min，于凝膠成像儀中觀察并記錄結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CA患者指尖HPV感染情況與性別比較采用卡方檢驗(yàn)，與年齡、病程比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 HPV DNA PCR結(jié)果 119份指尖樣本中，31份HPV DNA陽性，陽性率為26.1%。HPV DNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，見圖1。

注：1，2，3：陽性樣本；4，5：陰性樣本；6：陽性對(duì)照；7：陰性對(duì)照；M：Marker。

2.2 性別、年齡和病程對(duì)指尖HPV感染情況的影響 男性CA患者中指尖HPV感染率為29.8%(17/57)，高于女性的22.6%(14/62)，二者經(jīng)卡方檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.808，P=0.368)。指尖HPV陽性者平均年齡為31.74±6.79歲，低于陰性者的33.98±10.36歲，二者經(jīng)兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.119，P=0.266)。指尖HPV陽性者平均病程為5.74±4.40月，高于陰性者的4.41±2.12月，二者經(jīng)兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.213，P=0.029)。結(jié)果提示CA患者的性別和年齡與指尖HPV感染無關(guān)，而與病程長(zhǎng)短有關(guān)，時(shí)間越長(zhǎng)感染率越高。

3討論HPV是乳頭瘤病毒家族中能夠感染人皮膚或黏膜角化上皮細(xì)胞的一種約8 000個(gè)堿基對(duì)的DNA病毒[7]。HPV病毒體通過上皮組織微損傷與其受體-α整合素和層黏連蛋白結(jié)合并通過網(wǎng)格蛋白和/或小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入基底上皮細(xì)胞。全球HPV感染率高達(dá)12%[8]。目前已有170種HPV型完成基因組測(cè)序[9]，超過40種HPV型通過性行為傳播[10]。HPV的傳播途徑包括性接觸、母嬰傳播、密切接觸、間接接觸和醫(yī)源性感染等。直接性行為在HPV感染中已經(jīng)得到廣泛證實(shí)，但對(duì)于間接接觸感染，比如通過手-生殖器部位感染則研究不足。Hernandez等[4]每隔一個(gè)月對(duì)25對(duì)夫婦的生殖器和優(yōu)勢(shì)手進(jìn)行HPV檢測(cè)，平均隨訪7.5個(gè)月。研究發(fā)現(xiàn)有2對(duì)夫婦生殖器部位高危型HPV感染對(duì)方優(yōu)勢(shì)手，2例妻子優(yōu)勢(shì)手HPV傳染到丈夫的生殖器，1例妻子生殖器HPV傳染到丈夫的優(yōu)勢(shì)手，各有2例丈夫和妻子自己生殖器HPV傳染到自己的手。因此筆者認(rèn)為手部HPV的自身或性伴接觸可能在HPV感染過程中扮演重要角色。Winer等[5]對(duì)大學(xué)女生指尖進(jìn)行HPV檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，性活躍者指尖HPV陽性率為14%，而14例無性行為女生指尖均未檢出HPV。Winer等[6]另一項(xiàng)針對(duì)大學(xué)女生研究顯示，無插入性行為但有手-生殖器接觸者指尖HPV陽性率為10%，而無任何性接觸的76位女生僅1人指尖檢出HPV。因此研究者認(rèn)為HPV可通過感染者及其性伴的手傳染到生殖器部位。

CA是由HPV感染引起的臨床常見性傳播疾病[11，12]，而HPV的間接感染也時(shí)有報(bào)道。為了解CA患者手部HPV感染率以及HPV是否會(huì)通過CA患者手部進(jìn)行傳播，我們通過對(duì)國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，目前國內(nèi)外缺乏CA患者指尖HPV感染數(shù)據(jù)。為此我們通過招募性病門診確診為CA的患者，采用PCR方法檢測(cè)其指尖HPV感染情況。我們發(fā)現(xiàn)在119例CA患者中，有31例指尖檢出HPV DNA，陽性率為26.1%，其中男性和女性HPV指尖感染率分別為29.8%和22.6%，均明顯高于Winer等[5]報(bào)道的大學(xué)女生性活躍者指尖14%的HPV感染率，表明與無癥狀HPV感染者相比，CA患者指尖HPV感染率更高，更需要引起臨床重視。此外我們對(duì)指尖HPV感染者的性別、年齡和病程進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)：①男性CA患者中指尖HPV感染率高于女性，二者經(jīng)卡方檢驗(yàn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；②指尖HPV陽性者平均年齡為31.74±6.79歲，低于陰性者的33.98±10.36歲，二者經(jīng)兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；③指尖HPV陽性者平均病程為5.74±4.40月，明顯高于陰性者的4.41±2.12月，二者經(jīng)兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；結(jié)果提示CA患者的性別和年齡與指尖HPV感染無關(guān)，而與病程長(zhǎng)短有關(guān)，CA病程越長(zhǎng)指尖HPV感染率越高。

我們?cè)擁?xiàng)研究首次回答了CA患者指尖HPV感染情況以及感染相關(guān)危險(xiǎn)因素，為我們后續(xù)的夫妻間手-生殖器交叉感染、HPV型別與指尖HPV感染相關(guān)性研究提供數(shù)據(jù)支持，也為防控經(jīng)手HPV感染提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Rosenberg K，Mechcatie E．HPV vaccination and sexual behaviors in adolescents and young women[J]．Am J Nurs，2018，118(4)：69．

[2] Napolitano F，Navaro M，Vezzosi L，et al．Primary care pediatricians’ attitudes and practice towards HPV vaccination： A nationwide survey in Italy[J]．PLoS One，2018，13(3)：e0194920．

[3] 賴嘉希，柯吳堅(jiān)，劉 晗．人乳頭狀瘤病毒非性行為傳播途徑的研究現(xiàn)狀[J]．護(hù)理研究，2017，31(19)：2319-2320．

Lai JX，Ke WJ，Liu H．Research status quo of non-sexual transmission of human papilomaviruses[J]．Nursing Research of China，2017，31(19)：2319-2320．

[4] Hernandez BY，Wilkens LR，Zhu X，et al．Transmission of human papillomavirus in heterosexual couples[J]．Emerg Infect Dis，2008，14(6)：888-894．

[5] Winer RL，Hughes JP，F(xiàn)eng Q，et al．Detection of genital HPV types in fingertip samples from newly sexually active female university students[J]．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2010，19(7)：1682-1685．

[6] Winer RL，Lee SK，Hughes JP，et al．Genital human papillomavirus infection：incidence and risk factors in a cohort of female university students[J]．Am J Epidemiol，2003，157(3)：218-226．

[8] Schuster M．Human papillomavirus vaccines：WHO position paper，October 2014-Recommendations[J]．Vaccine，2015，33(36)：4383-4384．

[9] Kulhan M，Kulhan NG，Seven Y，et al．Estimation of the prevalence and distribution of HPV genotypes and identification of related risk factors among Turkish women[J]．Contemp Oncol (Pozn，Poland)，2017，21(3)：218-223．

[10] Han JJ，Beltran TH，Song JW，et al．Prevalence of genital human papillomavirus infection and human papillomavirus vaccination rates among US adult men：National health and nutrition examination survey (NHANES) 2013～2014[J]．JAMA Oncol，2017，3(6)：810-816．

[11] 杜偉平，米思蓉，王 麗，等．延安地區(qū)婦女HPV基因分型及臨床相關(guān)研究[J]．現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2018，33(1)：109-111，114．

Du WP，Mi SR，Wang L，et al．HPV genotyping and clinical studies of women in Yan’an area[J]．Journal of Modern Laboratory Medicine，2018，33(1)：109-111，114．

[12] 原 榮，李 軍，南 星，等．陜西省寶雞和咸陽兩地婦女HPV感染現(xiàn)狀和類型分析[J]．現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2017，32(6)：145-146，150．

Yuan R，Li J，Nan X，et al．HPV prevalence and subtypes analysis of women in Baoji and Xianyang area of Shaanxi province[J]．Journal of Modern Laboratory Medicine，2017，32(6)：145-146，150．